2、材料和方法

2.1. 材料

人血红蛋白 (Hb) 购自 Sigma-Aldrich 并按原样使用。 双子表面活性剂 乙烷-1, 2-diyl bis (N, N-二甲基-N-十六烷基乙酰氧基)二氯化物[16- E2-16]如[40]中所述合成，其结构为 如方案 1 所示。整个过程中都使用了 Millipore 水 实验。 Hb (5 μM) 的储备溶液在 100 mL 10 mM 磷酸钠缓冲液 (pH 7.4) 而 16-E2-16 的储备溶液在水中制备。 使用分光光度法测定 Hb 的浓度 280 nm 处的消光系数 118872 M-1 cm-1。

2.2. 方法

2.2.1. 表面张力分析

表面张力由 Delta-Pi Langmuir 测量 微张力计（Kibron，赫尔辛基，芬兰）基于杆上的最大拉力（Du Nouy-Padday）并利用小直径 (0.51 mm) 特殊合金线。 通过滴定法将16-E2-16加入到Hb溶液中。 样品的值是在 298.15 K、308.15K 和 318.15K。

测量池的温度由以下控制： Grant GD120 水温控器。 每次温度测量后，将合金线清洗并在酒精中干燥 火焰。

2.2.2. 吸光度测量

吸收光谱在配备珀耳帖型温度控制器的 Jasco-660 分光光度计中测量 (ETCS761)。 使用的蛋白质浓度为 5 μM，用于光谱 700–300 cm−1 范围内的测量值。 使用光程长度为 1.0 cm 的池。 将 2000 μL 的 5 μM 蛋白溶液放入 放入 1.0 cm 比色皿中，并用 20 μM 储备溶液滴定 16-E2-16。 每次滴定加入 40 μL，谱图为 记录。基线校正总是针对空白进行。

2.2.3. 荧光光谱测量

Trp荧光光谱和同步荧光光谱 在 Jasco 荧光分光光度计（FP-6200 型）中使用 3 mm 石英池在 25 ± 0.1 °C 下测量天然条件下的 Hb。 这 电池的温度通过来自外部恒温水浴的循环水来维持。 使用的蛋白质浓度 为 5 μM。 激发波长为 280 nm，发射光谱记录在 300-400 nm 波长范围内。 由缓冲液和表面活性剂组成的参考样品 检查荧光信号。 2000 μL 操作溶液 通过连续添加 40 μL 16-E2-16 (20 μM) 储备溶液来滴定 5 μM Hb。 滴定是通过使用手动完成的 一个微量移液器。 同步荧光光谱的波长间隔 (αl) 为酪氨酸残基 (Tyr) 为 20 nm 和 80 nm 分别为色氨酸残基 (Trp)。

2.2.4. 圆二色性测量

CD 光谱记录在 Jasco-715 分光偏振计上， 配备微型计算机。 仪器已校准 (+)-10-樟脑磺酸。 所有 CD 测量值均为 使用恒温控制的细胞架在 298K 下进行 连接到 Neslab RTE-110 水浴，精度为 ±0.1K。 蛋白质二级结构的变化是 使用 1 mm 路径在远紫外区域 (200–250 nm) 进行监测 长单元格。 来自含有缓冲液的参考样品的信号 并且从所有的 CD 信号中减去去污剂 测量。 CD 仪器定期用 D- 10-樟脑磺酸。 为了提高信噪比，在 每次扫描至少进行六次累积。 CD 数据被转换为浓度无关参数，平均残留量 椭圆度 [β] (deg cm2 dmol−1)，使用关系式 [43]

其中 θλ 是在波长处观察到的椭圆度（以毫度为单位） λ，M0 是蛋白质的平均残基重量，c 是蛋白质 以克/立方厘米为单位的浓度，l 是细胞的光程长度，以厘米为单位。 222 nm 处的椭圆度值 (θ222nm/mdeg)用于计算BSA的α-螺旋含量 使用 Morrisett 等人给出的以下等式。 [44]

2.2.5. 分子对接

进行分子对接以确定蛋白质 Gemini 表面活性剂结合亲和力、结合常数以及 识别潜在的结合位点和相邻的相互作用 Hb 和 16-E2-16 之间。 血红蛋白的晶体结构 (PDB ID: 2D60) 来自蛋白质数据库。 16-E2-16的结构由ChemDraw Ultra 8.0构建。 这 使用分子对接软件 AutoDock Vina [45] 进行对接实验。 盲对接是由 沿 x、y、z 轴将网格大小设置为 58、50、54，网格间距为 1000Å。 网格中心设置为 15.499Å、3.439Å、14.787Å。 如 AutoDock Vina 中所述使用默认参数 手动的。 总共进行了 10 次运行，然后 根据排名选择最低能量构象异构体 得分。 分子对接结果由 PyMOL [46] 呈现。

2.2.6. 分子动力学模拟

GROMACS 5.0 软件 [47,48] 用于进行 MD 对未结合和 16-E2-16 有界 Hb 的模拟。 建立 Hb 分子的电位，GROMOS96 43a1 力场 [49,50] 被应用。 16-E2-16的最低能量对接构象 用于MD模拟，内置拓扑参数 ProGrg 服务器 [51]。 未结合和 C16 结合的 Hb 被溶剂化 SPC 水模型 [52] 在十二面体盒中，包含 7174 和 6587 个分子。 添加单个钠离子 在两个系统中以中和整个系统。 那么能量为 两个系统都使用 800 步最速下降进行了最小化 算法后跟水箱中的共轭梯度法，用于释放冲突接触。 应用了两个最小化系统 在 300K 时达到 100 ps 的位置限制动态，其中 Hb 和 Hb-(16-E2-16)复合物通过添加抑制保持固定 然而，水分子被允许运动。 最后一步，两个系统的 MD 模拟在 300K、1 bar 和 0.1 ps 下的等温-等压合奏使用 贝伦森方法。 LINCS [53] 算法用于约束键长，允许使用 2 fs 时间步长。 范德 瓦尔斯和库仑相互作用在 1.2 nm 处被截断。 MD模拟的所有分析都是使用轨迹分析工具进行的 GROMACS 软件包。

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