结果和讨论

槐脂（SLs）相对较大的生产能力、可再生性和“生态友好性”有助于提高其作为家庭和个人护理产品中某些石化表面活性剂的添加剂或替代品的工业意义。 然而，为了考虑用于工业用途，SLs也必须廉价生产，并且必须了解和控制其物理性质，以便准确预测SLs在各种应用中的潜力。 表面张力（ST）、临界胶束浓度（CMC）、界面张力（IFT）和水溶性是表面活性剂应用特别关注的四个性质。 理想情况下，良好的表面活性剂是水溶性的，表现出较低的CMC，并导致最小表面张力（min.ST）小于30 mN/m。 这些性质中的每一种都可以根据表面活性剂的化学组成进行控制。 通过在多种不同的混合基质（包括葡萄糖和4种不同的脂肪酸）上生长棉铃虫，我们产生了具有不同化学分布的SLs。 简单地通过改变脂肪酸来生产不同的SLs的能力提供了在发酵水平上管理物理性质的前景，并通过在应用水平上以不同的比例混合SLs。

SLs可以以相对大量的生物方式生产，并且大多数SLs以乳糖形式合成，侧链主要从16到18个碳原子不等。 考虑到这一点，进行了发酵，其中利用棉铃虫从棕榈酸（一种C16:0脂肪酸）和三种不同的C18脂肪酸[包括硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）和亚油酸（C18:2）]合成SLs 希望由此产生的SLs的大部分侧链能够反映起始脂肪酸底物。 然后，通过混合各种SLs，可以实现性能控制，而无需进行化学改性，这会增加分子的总体成本。 在所采用的发酵条件下，棉铃虫生长并合成SLs，棕榈酸产量为42 g/l，硬脂酸产量为77 g/l，油酸产量为98 g/l，亚油酸产量为40 g/l。 与棕榈酸（SL-p）和亚油酸（SL-l）的SL产率相比，硬脂酸（SL-s）和油酸（SL-o）的SL产率增加，主要是由于酶对硬脂酸和油酸作为SL侧链成分的偏好。 众所周知，pH值影响酶的效率。 在所有四种SL发酵中，添加脂肪酸后的起始pH值为5.8±0.2，虽然在发酵过程中pH值未得到控制，但在细胞开始生长的24小时内（接种后）对其进行了监测， 每次发酵的pH值降低至pH值2.5±0.5，在整个发酵过程中保持不变。 在所有情况下，无论添加何种特定脂肪酸，发酵过程中的pH条件都是可比的； 因此，SL产量的差异似乎是酶底物特异性的结果，而不是pH值的差异。

图2显示了生产的4种SLs的总离子色谱图（TIC）。 在每种情况下，主峰在15分钟以上洗脱。SL-p和SL-l（图2a，d）均显示5个主峰，而SL-s和SL-o（图2b，c）各只有3个主峰。

图2葡萄糖和棕榈酸（SL-p；a）、硬脂酸（SL-s；b）、油酸（SL-o；c）和亚油酸（SL-l；d）生产的槐脂产品的总离子色谱（TIC）曲线

在B和C中，在15和20分钟之间没有任何明显的峰表明，在A和D中在15和20分钟之间洗脱的峰对应于含有棕榈酸和亚油酸的SLs，在21分钟和25分钟洗脱的峰分别对应于含有油酸和硬脂酸的SLs。 大气压化学电离质谱（APCI-MS）证实了这一点。 图3显示了TIC中每个基峰的APCI-MS。

在每个质谱图中，无论分子是什么，峰都显示出相同的趋势。 例如，每一个质谱图都显示了一个对应于质子化分子离子（[M]+）的大的基峰。 根据SL侧链中的长度和不饱和度，该峰值在m/z 663（图3a）到m/z 691（图3b）、m/z 689（图3c）和m/z 687（图3d）之间变化。 在每种情况下，[M]+离子依次失去总共3个水分子，从而产生M/z值比之前离子少18个质量单位的离子。 此外，每个[M]+损失了一个乙酰化己糖（质量=204个单位），分别导致[M]+-204个M/z 459、M/z 487、M/z 485和M/z 483值（图3a至d），另外损失了2个水分子。 最后，图3a至d中m/z 273、m/z 301、m/z 299和m/z 297处的离子分别对应于与每个SL分子相关联的质子化羟基脂肪酸（[FA（OH）]+）。 通过使用与每个峰相关的值，可以识别TIC中的每个峰，并量化每个SL分子的绝对分布。 正如所希望的那样，每个脂肪酸底物产生大量的SL分子，其中包含作为侧链成分的特定脂肪酸。 明确了对硬脂酸和油酸的偏好，因为即使使用棕榈酸和亚油酸作为底物，这两种脂肪酸在SL侧链中也以可测量的数量存在。 这些结果表明，在形成SL分子之前，棉铃虫将至少部分底物脂肪酸酶转化为硬脂酸或油酸。 相比之下，SL-s和SL-o的TIC色谱图在15到20分钟之间缺少峰值，这表明在SL合成之前很少发生棕榈酸或亚油酸的转化，从而证明了在SL合成中酶对硬脂酸和油酸的偏好，并进一步解释了SL-s和SL-o产量增加的原因。

图3正大气压化学电离（APCI）-来自图2中每个TIC色谱图基峰的质谱图。 图2的TIC中的C16:0二乙酰化槐脂内酯（RT=16.7分钟）、图2的TIC中的C18:0二乙酰化槐脂内酯（RT=25.2分钟）、图2c的TIC中的C18:1二乙酰化槐脂内酯（RT=20.7分钟）和图2d的TIC中的C18:2二乙酰化槐脂内酯（RT=15.8）。 （[M]+=质子化分子离子；[M]+-204=质子化分子离子-减去乙酰化己糖（质量204）；[FA（OH）]+=质子化羟基脂肪酸）

TIC（图2）中对应于含有棕榈酸、硬脂酸和油酸的SLs的峰均显示具有相同质谱的第二个峰。 根据之前报告的数据（Nun〜ez et al.2001），我们得出结论，在这两个峰中，首先洗脱的峰对应于结构变化，槐糖环的10-羟基和脂肪酸的x-1碳之间存在糖苷键，而随后的洗脱峰（通常是除SL-p外的一个次要峰） 通过糖环与脂肪酸的x碳之间的糖苷键连接。 根据APCI-MS结果，确定在每种情况下，无论底物如何，超过92%的SL分子为内酯构象（表1）。

表1：通过LC/APCI MSa测定的由C.bombicola从棕榈酸（SL-p）、硬脂酸（SL-s）、油酸（SL-o）、亚油酸（SL-l）酸生产的槐脂的结构含量（开链与内酯）

无论乙酸乙酯萃取时间长短，情况都是如此。 我们的方案包括三次单独提取，每次提取两天。 选择这些时间是为了最大限度地提高溶解度，从而提高SL回收率。 然而，通过检查作为时间函数的优先溶解度，确定TLC板上形成的斑点数量与每个SL样品（见图2）的TIC中存在的化合物数量相对应，这些化合物通过APCI-MS鉴定为二乙酰化内酯（见图3）。 表2显示了每个SLs的绝对分布，包括x与x-1连杆的比率（如可能）。

表2：根据羟基脂肪酸含量，由C.bombicola从棕榈酸（SL-p）、硬脂酸（SL-s）、油酸（SL-o）、亚油酸（SL-l）及其混合物中生产的槐脂的二乙酰化内酯分布

在4个SL中，只有一个SL-p的x-连杆总数大于x-1-连杆。 具体而言，在75%的棕榈酸残基中，39%通过x位置连接，36%通过x-1位置连接。 在其他情况下，大部分（至少71%）的脂肪酸通过x-1位置结合（亚油酸在所用LC方法下不可溶解，因此被报告为x和x-1组合结构）。 这些结果表明，为了形成内酯，糖苷键和酯键之间必须至少有15个甚至17个碳单元。 SL-o和SL-s中对x-1连接的极大偏好表明17个碳是内酯形成的首选碳。 然而，通过将棕榈酸连接到x碳处的SL，链长度增加了1个碳单元（键间16个碳），使得内酯的形成比连接到x-1碳（键间15个碳）时更有利。 SL-p中存在C17:0脂肪酸含量较低（3%）的SLs进一步证实了这一点，而SL-s、SL-o和SL-l中没有C17:0脂肪酸夹杂的迹象。 根据这些数据和二乙酰化内酯分布（见表2），得出结论，对于SL包裹体测试的单个脂肪酸，其优先顺序为油酸、硬脂酸、棕榈酸和亚油酸，以及C18脂肪酸， 单原子饱和优于饱和和双不饱和。

测试表面活性性质，以确定每种SL对水溶性、最小ST、CMC和IFT的影响。 我们发现SL-p和SL-l的水溶性均大于200mg/l，而SL-s和SL-o的水溶性均小于200mg/l。 图4显示了SL浓度对水表面张力的影响（图4a）和流速对IFT的影响（图4b）。

图4槐脂浓度和流速对水溶液中的表面张力（a）和界面张力（b）的影响，包括来自葡萄糖和棕榈酸（SL-p；d）、硬脂酸（SL-s；s）、油酸（SL-o；）和亚油酸（SL-l；r）的槐脂。

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