结果与讨论

3.1.适用于印刷纳米颗粒的薄膜的机械性能

表1显示了在两种不同浓度（1%和2%w/v）下获得的Qo薄膜和由Qos与EPQ的不同共混物制备的混合薄膜的机械性能。Qo薄膜和混合薄膜没有显着差异（p<0.05)厚度（约200微米）。1.5%(w/v)Qo薄膜的%E(51.3±1.7%)明显高于2.0%(w/v)Qo薄膜(45.9%±1.6)；然而，TS值不受影响（分别为14.4±0.9 MPa和15.4±1.8 MPa）。

据报道，由高分子量Qo制备的薄膜具有高TS值。这些高TS值归因于成膜时Qo分子的高线性排列，这是由于聚合物的羟基和氨基与用作溶剂的水之间的氢键产生的分子内和分子间相互作用（Butler,Vergano,Testin,Bunn,&Wiles,1996;Caner,Vergano,&Wiles,1998;Muzzarelli,1977)。

对于混合膜，只有Qo/EPQ质量比为90:10(12.8±0.5 MPa)的混合物的TS值与Qo膜相似。对于Qo/EPQ的其他质量比，TS值随着混合物中EPQ比例的增加而成比例地减小（当Qo/EPQ为50:50时高达8.0倍）。这些结果与之前的报道一致，即Qo薄膜的机械强度随着混合物中蛋白质分数的增加而降低（Abugoch等人，2011年；Pereda、Aranguren和Marcovich，2008年；Valenzuela等人，2013年）。

观察到混合膜的%E的两种类型的行为。当EPQ在混合物中的比例在10%到30%之间时，随着EPQ在混合物中比例的增加，%E显着降低。这种效果归因于藜麦蛋白的氨基酸破坏了柠檬酸和Qo（柠檬酸Qo）之间的相互作用（相对于Qo柠檬酸盐的薄膜降低了%E）。这种相互作用的中断降低了柠檬酸的增塑作用（Olsson、Johansson和J€arnstr€om，2014年）。该结果也与Khan、Peh和Chang(2000)报道的结果一致，他们观察到由于柠檬酸的增塑作用，使用柠檬酸制备的Qo薄膜的机械性能优于使用乳酸或乙酸制备的薄膜。.柠檬酸的增塑作用归因于亲液阴离子或结构缔造剂的性质，它们加强了水和Qo之间的氢键网络，有助于薄膜的分子内和分子外稳定性（Lopez-Leon、Ortega-Vinuesa,Bastos-Gonzalez,&Elaissari,2014）由于柠檬酸在Hofmeister系列中的高盐析效应（Yamaguchi、Iizuka、Osaka、Monma和Tanaka，2003年）。

随着EPQ含量从40%增加到50%，E%增加了大约2.5倍，这很可能是由于在电离Qo的氨基和藜麦蛋白的自由基之间形成了聚电解质复合物（通过氢键稳定）（Abugoch等人，2011年）。

表1壳聚糖薄膜(Qo)和Qo/EPQ混合物(Qo/EPQ)薄膜的机械性能。不同字母表示差异显着（p<0.05）。

需要低自粘性以促进薄膜处理。最大剥离力(MDF)用作衡量薄膜自粘力的指标。随着Qo的浓度从1.5%w/v(1.7±0.1 N)增加到2.0%w/v(2.4±0.1 N)，Qo薄膜的MDF显着增加。对于混合膜，MDF值明显高于Qo膜。这些值随着混合物中EPQ比例的增加而增加（20%EPQ为4.6±0.4 N，混合物中50%EPQ为6.2±0.5 N）。这种增加可能归因于薄膜的含水量，这影响了亲水薄膜的粘附性。Qo薄膜的水分含量(14.7±0.7%)明显低于Qo/EPQ薄膜(17.5±0.6)。此外，据报道，伯胺（赖氨酸部分的）和蛋白质的硫醇基团（SH）与Qo的氨基之间的相互作用增加了由Qo和蛋白质形成的水凝胶的粘附性（Bouten等人，2014）。

在模拟浆果储存的条件下（室在0冷凝和85%RH）下评估薄膜的吸水行为7天。与Qo薄膜（1.5%和2.0%w/v）相比，混合薄膜(90:10)的保水性（g水/g干膜）增加了3.0倍。对于Qo/EPQ薄膜，EPQ百分比从20%到50%不等，观察到更高的保水率，高达75%。这种保水性的增加可归因于两种薄膜中存在的可电离基团比例的差异。由于藜麦蛋白氨基酸的自由基基团的电离(Abugoch,2009)和制备成膜溶液的pH值(pH 3.5)，混合膜具有更多的电荷。在此pH值下，去质子化谷氨酸(pKR 4.25)和天冬氨酸(pKR 3.65)的羧基(eCOOe)和精氨酸(pKR 12.48)、组氨酸(pKR 6.00)和.5KR赖氨酸(pKR 6.00)的质子化胺基(NH3+))主要存在(Nelson&Cox,2006,chap.3)。因此，与Qo膜相比，由于唐南平衡，混合膜将表现出更大的水分子向蛋白质-多糖复合物内部的扩散（Davis,Yezek,Pinheiro,&van Leeuwen,2005;Freudenberg,Zimmermann,Schmidt,Holger Behrens,&Werner,2007)。在Qo膜中质子化的自由基较少，因此电渗唐南电位的影响降低，因为聚合物链形成有序、紧凑、紧密堆积的结构，留下较小的体积可用于与水分子相互作用（Caner et al.,1998;Wiles、Vergano、Barron、Bunn和Testin，2000）。

选择1.5%(w/v)Qo薄膜和90:10的Qo/EPQ比率进行打印，因为它们的机械性能（TS、%E和MFD）适合在打印机中使用（意味着对打印机没有可见的损坏）由于印刷装置产生的牵引力而导致印刷薄膜的结构）。此外，这些薄膜所表现出的吸水量减少将允许它们用作新鲜水果储存的包装材料。

3.2.NQoThs的制备和表征

表2显示添加20%甘油(v/v)导致表面张力和运动粘度值类似于商业油墨溶液报告的值（de Gans、Duineveld和Schubert，2004年；Khan等人，2010年）。这确保了打印头真空产生的液体的快速更换，从而防止纸基质过度滴落或润湿（Kipphan，2001）。

基于纳米颗粒相对于不含甘油的NQoTh分散体的尺寸变化（z平均值）和z电位，评估了添加甘油(20e30%v/v)对NQoThs分散体性质的影响.

含20%(v/v)甘油的NQoThs的z电位(42.1±4.84 mV)显着高于含30%(v/v)甘油的NQoThs(37.3±2.71 mV)。添加30%(w/v)甘油后，多分散指数(PDI)增加了约25%。

这些结果表明，甘油与溶液中的NP相互作用，使表面免受电荷的影响，降低了zeta电位，降低了颗粒之间的静电排斥，诱导了团聚，从而增加了颗粒的尺寸和PDI。Khoee、Sattari和Atyabi(2012)报道甘油诱导NP之间的聚结。相比之下，Müller、Jacobs和Kayser(2001)证明了具有30 mV电位和PDI小于0.7的NPs是稳定和功能性的；因此，在研究范围内添加甘油不会影响NQoThs的稳定性。

含30%(w/v)甘油(417.4±53.1 nm)的NP的Z平均值比含20%(w/v)甘油(383.8±58.8 nm)的NP观察到的高25%。尺寸通过TEM显微镜确定。图1显示了在没有甘油（图1A）和添加20%(w/v)甘油（图1B）的情况下NQoThs的显微照片。如上所述，添加20%甘油抑制了NP团聚。表2比较了TEM和动态光散射(DLS)确定的NP尺寸。使用DSL确定的值比TEM确定的值高近10倍，因为TEM直接测量干燥样品，而Zetasizer系统确定尺寸首先通过DLS测量样品中由于周围粒子轰击（布朗运动）而引起的液体中粒子的随机运动，然后使用StokeseEinstein方程（Akbari、Pirhadi和Zandrahim，2011年）从该运动中推断出大小。

3.3.通过热注射打印纳米颗粒

将Th掺入Qo膜的结果如表3所示。随着印刷NQoTh层数的增加（在膜的同一侧印刷1到4次），两种膜中的Th量都增加了。在Qo膜中，随着分散体中分别加入20%和30%的甘油(v/v)，Th从0.07增加到0.22 mg/cm3和从0.06增加到0.15 mg/cm3。Th浓度的这种增加是显着的（随着印刷层数的增加，薄膜增加了3.14倍）。类似地，在Qo/EPQ薄膜中，从第一次印刷到第四次印刷，Th增加了31e33%（从0.05到0.16 mg/cm3，从0.03到0.09 mg/cm3，使用20%和30%的甘油(v/v)NQoTh分散体）。当应用更多印刷层时，分散体从20%和30%甘油NQoTh分散体中滴落。

使用20%甘油(v/v)可获得更高的Th分散结合效率；Qo薄膜为7.54%，Qo/EPQ薄膜为5.54%。这些值分别比使用30%甘油(v/v)获得的效率高20%和35%。

这是在Qo薄膜中使用这种技术掺入活性剂的第一份报告。布安兹等人。(2011)报告称，使用HP D1660打印机型号（最大分辨率为4800*1200 dpi），沙丁胺醇醋酸纤维素片材（A4透明胶片）的掺入效率更高，为85%。在Qo和Qo/EPQ薄膜中掺入Th的效率低可归因于用于印刷的基质的特性和/或印刷设备的低分辨率(600 dpi)。另一个重要因素是打印头和打印表面之间的距离。为了减少这个距离，Mel?endez等人。(2008)使用增强型Alfaglas®，一种涂有惰性特氟龙的商用聚四氟乙烯(PTFE)薄膜，以减少印刷过程中的活性损失。

表2甘油对纳米颗粒悬浮液物理性质和纳米颗粒的粒径和zeta电位的影响。不同字母表示显着差异（p<0.05）。

图1.TEM显微照片NQoTh悬浮液。(A)NPs的分散和(B)添加了甘油(20%w/v)的Nps分散。

表3注射到薄膜Qo和Qo/EPQ中的百里酚量(mg/cm3)作为印刷次数的函数。不同字母表示显着差异（p<0.05）。

另一个考虑因素是来自打印头的液滴与打印矩阵之间的接触角。图2显示了在Qo和Qo/EPQ薄膜表面上的2 mL滴含有20%和30%(v/v)甘油的NQoTh分散体的接触角。含有20%甘油(v/v)的NQoTh分散体表现出更高的接触角，为85.11?和55.69？分别对于Qo和Qo/EPQ薄膜，而对于含有30%(v/v)甘油的悬浮液，接触角降低至69.16?和47.50？分别在Qo和Qo/EPQ薄膜中。随着甘油浓度的增加，接触角的减小归因于当甘油浓度从20%v/v增加到30%v/v时，分散体的表面张力从49.3 mN/m增加到53.1 mN/m（参见表2)。因此，在两种薄膜中掺入Th的效率与接触角成比例增加。这些结果与Genina等人的结果一致。(2013)，他检查了用甲磺酸雷沙吉兰(RM)印刷的3种材料：多孔复印纸、防水透明醋酸纤维素(A4)和由羟丙基甲基纤维素/交聚维酮制备的口腔分散膜（与本工作中研究的膜最相似）.他们获得了69.0°、61.4°的接触角。和34.4?，分别。口腔可分散膜的RM比透明醋酸纤维素(A4)低25%，RM比多孔复制基质小50%。

图2.在Qo膜（上）和Qo/EPQ（下）之间由添加了20%和30%(v/v)的甘油的液滴NQoTh分散体形成的接触角。

3.4.显微结构

Qo和Qo/EPQ的印刷膜示于图3A和F。图3B示出了Qo膜的横截面，图3G示出了EPQ/Qo膜的横截面。Qo膜具有均匀、柔软、光滑、连续的结构，具有良好的完整性和孔隙。相比之下，混合膜具有带有孔隙和裂缝的异质结构。Qo-乳清蛋白薄膜（Kurek、Galus和Debeaufor，2014年）和Qo-明胶薄膜（Kurek等人，2012年；Rivero、García和Pinotti，2009年；Torres、Aimoli、Beppu和弗雷利希，2005年）。这些作者将这些由碳水化合物和蛋白质混合物制备的薄膜的异质结构归因于干燥过程（溶剂前沿的迁移）。Qo/EPQ薄膜的干燥时间是Qo薄膜的1.8倍，表明水分子通过混合薄膜的扩散速度较慢。此外，混合物的pH值(pH 3.8)接近藜麦蛋白的等电点(Abugoch,Romero,Tapia,Rivera,&Silva,2008)，这可能会引发复杂的凝聚和某些蛋白质组分的沉淀，导致Ferreira等人描述的热力学不相容性。(2009)，当乳清蛋白和Qo的混合物被酸化以获得混合膜时，他观察到了这种现象。

Qo膜的表面（图3D）光滑平整，没有孔隙或裂缝。几位作者报告了Qo薄膜的高度结构同质性（Abugoch等人，2011年；Fern?andes、Freire、Silvestre、Neto、Gandini等人，2010年；Valenzuela等人，2013年；Vargas、Albors、Chiralt和

图 3. 加入的 NQoTh 热喷墨薄膜的图片和 SEM 显微照片。  上：Qo喷墨薄膜（A）图片Qo喷墨薄膜，（B）和（C）Qo薄膜横截面；  (D) 和 (E) 上表面。  下图：Qo/EPQ

喷墨薄膜（F）图片 Qo/EPQ 喷墨薄膜，（G）和（H）截面；  (I) 和 (J) 上表面。

与Qo膜（图3C）相比，混合膜的孔隙率使NQoThs分布更深（图3H）。在表层，NQoThs主要聚集在打印设备的面板上（图3E和J）。印刷的NQoThs在两种薄膜的内部和表面都保留了它们的球形形状和明确的几何形状。

图4.(A)Qo薄膜控制和Qo NQoTh 11薄膜和(B)Qo/EPQ薄膜控制和Qo/EPQ NQoTh薄膜的X射线衍射曲线和结晶度(%)。

3.5.X射线衍射

图4显示了Qo薄膜、印有NQoThs的Qo薄膜（图4A）、Qo/EPQ薄膜和印有NQoThs的Qo/EPQ薄膜（图4B）的衍射图。Qo薄膜是半结晶的，在19.8?处显示出一个峰值，这是Qo薄膜的典型特征（Zhong、Song和Li，2011）。Qo膜还在29.3度处出现峰值，这对应于柠檬酸（Valenzuela等人，2013年）。Qo/EPQ薄膜在20.0度和29.4度处表现出尖锐、明确的峰，比Qo薄膜中观察到的峰更强烈。Qo/EPQ薄膜还在35.9度、39.4度、43.2度和47.5度处出现衍射峰，表明藜麦蛋白和Qo之间存在分子间相互作用（Valenzuela等，2013）。

印有NQoThs的Qo薄膜在39.4?和57.3?，分别对应于柠檬酸和Th（数据未显示）。在印有NQoThs的Qo/EPQ薄膜中也观察到后者。这两个新峰与两种类型薄膜上纳米颗粒的表面沉积物有关，与SEM观察结果一致（见图3B和F）。

Qo和Qo/EPQ薄膜以及两种印刷NQoThs薄膜的结晶和非晶百分比如图4所示。值得注意的是，在具有NQoThs的Qo和Qo印刷薄膜（14.5和14.4）中没有观察到结晶度百分比的差异％，分别）。Qo/EPQ薄膜(15.8%)与印有NQoThs的Qo/EPQ薄膜(15.6%)之间的结晶度百分比差异不显着。这些结果表明两种薄膜的结晶度都不受NQoThs印刷的影响。这一结果与之前的报道一致，即通过喷雾、真空冷冻干燥或通过搅拌掺入成膜淀粉分散溶液中产生的淀粉NPs阻止了含有NPs的薄膜结晶区域的形成（Shi，Wang，Li和Adhikari，2013年）。

3.6.NQoThs印刷薄膜储存后的机械性能和WVP

在储存前后测量了印有4层NQoThs的薄膜的机械性能和WVP，这些结果如表4所示。

在冷室中储存30天显着增加了薄膜的%E断裂伸长率，而机械强度(TS)显着降低。这些影响归因于在这些条件(85%RH)下从薄膜中增加的水吸收以及随之而来的对薄膜增塑剂的影响。

对薄膜类型（Qo和Qo/EPQ）、NP的掺入（对照/NQoTh）以及储存时间在0?和85%RH（0天和30天）作为主要因素，%E和TS作为响应变量。所有主要因素显着影响薄膜的%E如下：a)Qo薄膜的伸长率比Qo/EPQ薄膜高18%；b)NQoThs的添加使%E降低了7%；c)在冷室中的储存时间使%E增加了40%。此外，这两种互动，电影的类型？添加NP和添加NP?存储时间，意义重大。影片的互动类型？详细检查了NPs的添加（图5）。加入NQoThs后，Qo薄膜的%E（见图5A）下降了75%，而Qo/EPQ薄膜的%E增加了8.2%。在印刷NQoThs后，Qo薄膜的TS降低了3.0%，而NQoThs的添加使Qo/EPQ薄膜的TS值增加了66%（见图5B）。这些差异可能归因于Qo和Qo/EPQ薄膜之间的微观结构差异（图3）。Qo/EPQ薄膜是异质和多孔的，这将允许NQoThs更深地结合到微观结构中。相比之下，Qo薄膜具有均匀致密的微观结构，因此NQoThs只能印刷在薄膜表面。

没有NQoThs的Qo和Qo/EPQ薄膜在85%RH和0降温下的WVP值没有显着差异（p>0.05）。通过印刷添加4层NPs后，Qo薄膜的WVP降低了33%，混合薄膜的WVP降低了13.3%。WVP的这种降低是由于添加NP导致系统曲折增加（Adame和Beall，2009年；Clapper等人，2008年）。

3.7.抗菌活性

将NQoThs纳入电影的主要目标是增强两种类型电影中的Qo的AM。据报道，Qo的AM取决于内在因素，例如脱乙酰度、状态（溶液或薄膜）和分子量。后一个特征是最相关的特征之一。Kong、Chen、Xing和Park(2010)证明，当使用更高分子量的Qo（Dutta、Tripathi、Mehrotra和Dutta，2009年）时，AM会显着降低（高达95%）。此外，当Qo与其他聚合物（如蛋白质和/或脂质）结合时，Qo的AM会降低（Rabea等，2003）。因此，为了克服这些限制，将用QoLMW制备并负载Th（一种已知的抗菌化合物）的NP添加到薄膜中。

图5.Type Film和NQoTh之间的相互作用(A)断裂伸长率效应和(B)拉伸强度效应。

表4储存30天后通过4层热喷墨掺入和未掺入NQoTh的薄膜的机械性能和水蒸气渗透性能。不同字母表示显着差异（p<0.05）。

表5储备溶液NQoTh和Qo/Th混合物的分散对本研究中使用的微生物的添加剂或协同效应的定量评估。

Th和QoLMW的最低抑制浓度(MIC)是针对本研究中测试的每个菌株独立确定的：在鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和产气大肠杆菌中，Th为0.250 g/L，QoLMW为1.0 g/L；L.innocua中Th为0.275 g/L，QoLMW为0.8 g/L；铜绿假单胞菌中Th为0.225 g/L，QoLMW为1.0 g/L；金黄色葡萄球菌中Th为0.275 g/L，QoLMW为1.0 g/L。这些浓度与Guarda等人报告的浓度相似。(2011)为Th和Goy、de Britto和Assis(2009)为QoLMW。

将NQoTh纳米颗粒分散体的AM与用于制造NP（QoLMW/Th的混合物）的储备溶液的AM进行比较。对于所有测试的微生物，NQoThs对微生物的活力表现出强大的影响，在NQoThs的原液分散体稀释90%时实现了生长抑制。对于S.typhimurium、E.coli和E.aerogenes，QoLMW/Th溶液的60%稀释会抑制微生物的活力。铜绿假单胞菌、无害乳杆菌和金黄色葡萄球菌在80%(v/v)稀释时被NQoThs抑制，而QoLMW/Th溶液需要60%(v/v)稀释。

本研究的一个目标是确定对微生物的影响是否是由于组分的协同或相加作用。通过根据NQoThs中存在的百分比（QoLMW为75%，Th为25%）对QoLMW和Th的MIC进行加权，将NQoThs的MIC与附加效应的估计值进行比较。NPs(NQoTh)和QoLMW/Th原液的MIC值均低于基于组分加和效应估计的MIC，表明Qo和Th之间存在协同效应（见表5）。然而，取决于测试的细菌，NPs的MIC比库存QoLMW/Th混合物低大约1.5到4.5倍。Wazed Ali、Rajendran和Joshi(2011)评估了使用TPP从440-kDa Qo的1.0%(w/v)溶液中产生的NQo(115.5 nm)的AM抗金黄色葡萄球菌。NQo比Qo原液更有效地抑制这些细菌的生长50%。

还评估了印有NQoThs的薄膜的AM。薄膜与上述指定的细菌菌株在37℃下孵育24小时。结果列于表6中。用NQoThs印刷的Qo薄膜表现出比对照薄膜更大的AM，证明了薄膜中Th的释放以及Qo和Th的协同效应。与对照薄膜相比，用NQoThs印刷的混合薄膜也表现出AM的增加。对于所有菌株，印有NQoThs的Qo薄膜产生更大的抑制区，这可归因于NQoThs在基质中的排列和位置以及薄膜中更大的Th负载（图3和6A）。在所有微生物测试中，NQoThs对革兰氏阴性菌株的活性高于革兰氏阳性菌株。这种效应很可能是由于外膜和脂多糖中存在的脂肪酸和磷酸盐的负电荷（Du、Niu、Xu、Xu和Fan，2009年；Kong等人，2010年）。

3.8.从薄膜中释放Th由于难以确定活性剂从复杂基质中的释放，因此可以在水中评估活性成分的释放，以模拟饱和蒸汽室中新鲜水果的储存条件（0冷凝，85%RH）。多项研究表明，这些类型的结果具有代表性（Brandsch、Mercea、Rüter、Tosa和Piringer，2002年；Grob，2008年；Paseiro-Losada、Simal、Abuín、Lopez和Gandara，1993年；Philo、Fordham、Damant和城堡，1997年）。在这项研究中，通过在Franz细胞中的渗透性测试研究了薄膜中的Th释放。结果如图6所示。在下沉条件下评估Th从薄膜中的释放，即在活性剂的浓度低于其水溶性的10%（1000 ppm在25℃下），通过应用能斯特和布伦纳定律（Ely、Garcia和Thommes，2014年）。

表6通过热喷墨将NQo和NQoTh结合到Qo和Qo/EPQ薄膜中的径向扩散的生长抑制区(mm2)。对于每种纳米颗粒溶液，薄膜印刷4次。不同字母表示显着差异（p<0.05）。

图6.从使用NQoTh印刷4次的薄膜Qo和Qo/EPQ中释放百里酚(A)0天（初始负载Th）、第1天和第8天的释放曲线和（B）室温下8天测定的百里酚释放动力学温度。

图6A显示了用Qo(0.22±0.01 mg/cm3)和Qo/EPQ(0.16±0.01 mg/cm3)印刷的薄膜中Th的初始电荷。24小时后（第1天），Qo膜释放0.11±0.004 mg Th/cm3，而混合膜释放0.01±0.002 mg Th/cm3。在测试结束时（第8天），两种薄膜都释放了薄膜中印刷的所有Th。图6B显示了在室温下进行的8天测试期间，两种薄膜中Th(%)的不同释放动力学。Qo薄膜在前24小时内经历了Th的快速释放（Th的51.1±2.2%）。在第2天，主动释放遵循持续的指数行为，释放率为75.8±1.9%。测试72小时后，这些薄膜中Th的释放变得缓慢且受控(78.8±2.2%)，并保持恒定，直到第8天达到100%Th释放。相比之下，混合膜表现出延迟的Th释放动力学。在最初的24小时和48小时内，Qo/EPQ薄膜分别释放了3.5±1.7%和6.5±1.7%的Th，比Qo薄膜低（平均）约13倍。混合膜的释放在第三天增加到37.2±4.0%，第四天呈指数分布，释放率为67.9±6.1%。第4天后，如在Qo薄膜中所观察到的，Qo/EPQ薄膜在第8天之前表现出缓慢的受控释放。释放曲线的差异可归因于薄膜中印刷的NQoThs的位置。通过SEM观察，Qo薄膜中的NPs积聚在表面并且更容易接触到水。相比之下，混合膜（由于它们的孔隙率）允许NQoThs更大程度的内化，因此降低了NPs对溶剂的可及性。这些结果与我们的微生物测试一致，证明用NQoThs印刷的Qo薄膜比混合薄膜具有更高的AM。

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