摘要

精子结合蛋白（BSP）是牛精浆中的主要蛋白质，已知其部分插入精子膜的外小叶，并与其中存在的含胆碱脂质结合。这种插入通过诱导精子早期获能，对冷冻保存后的精液质量产生负面影响。BSP蛋白表面性质的假设通过张力测定法进行了验证：BSP蛋白具有高度的表面活性。这表明BSP蛋白不仅通过相互之间的相互作用，而且由于其自身的表面活性，能够到达磷脂覆盖的界面。BSP蛋白插入精子外小叶的脂质结构域是在类似Langmuir单分子膜的仿生系统上复制的。BSP蛋白的插入可以在含有胆碱脂质的可压缩流体域中进行。单层膜也被用来研究BSP蛋白与两种磷脂组装物的络合作用：蛋黄低密度脂蛋白（LDL）或鸡蛋磷脂脂质体。无论磷脂结构（脂蛋白或脂质体）如何，BSP都不能改变膜的结构。只有BSP蛋白与磷脂酰胆碱的总比例是重要的。这两种螯合剂的区别在于它们的表面性质：LDL有很强的与外层结合的倾向，而脂质体主要以相同的时间尺度保持在本体中。

1、介绍

精子结合蛋白（BSP）是一个已知在输卵管精子储存库的形成和精子获能中起作用的蛋白质家族，精子成熟是受精的关键步骤[1,2]。在牛精浆中，根据Manjunath等人的命名法[2]：BSP1[4]、BSP3[5]和BSP5[6,7]分别鉴定和分类了三种比例为10:1:1的主要BSP蛋白[3]。BSP1和BSP3的表观质量为15–16.5 kDa，BSP5的表观质量为28–30 kDa[6,8]。这三种蛋白质由一个独特的N端结构域和两个纤维连接蛋白II型结构域组成。只有三种BSP蛋白的N端结构域存在显着差异[4–6]。每个纤维连接蛋白II型结构域包含一个磷酰胆碱结合位点[9–14]。最后这些是BSP蛋白的生物学作用所必需的。事实上，精子膜的外小叶在射精过程中与含有BSP蛋白的精浆接触[2,15]。BSP蛋白与精子膜上的含胆碱磷脂（如磷脂酰胆碱和鞘磷脂）快速结合[9,12,16–19]，并通过部分插入精子质膜的外小叶[1,13,20]覆盖精子表面。这是通向输卵管精子储存库和精子获能的第一个关键步骤。BSP蛋白既可溶又能插入疏水膜的事实证明BSP蛋白具有两亲性。因此，本研究的第一部分旨在通过进行张力测量来检验这一假设。

BSP蛋白诱导的早期获能[21,22]对冷冻保存后的精液质量有负面影响，因为它会导致抗冷性和抗冻性的丧失[12,17,23–25]。因此，保护器的存在对维持精子质量至关重要。蛋黄被广泛用于分离BSP蛋白[17,26–32]。这种隔离是由于蛋黄中存在的低密度脂蛋白（LDL）外层的磷脂酰胆碱与BSP蛋白之间的特异性和强相互作用[9,12,33,34]。在某些情况下，还假设低密度脂蛋白对精子早期获能的保护作用是由于富含磷脂的低密度脂蛋白极性脂质与由于外排而减少的脂质和胆固醇的精子膜之间的交换[29]。目前，大豆卵磷脂等其他磷脂被用作蛋黄磷脂的替代品。然而，在这种情况下，脂质体和膜之间可能的相互作用尚不清楚。因此，本研究的第二部分旨在比较低密度脂蛋白和脂质体与脂膜接触的行为。为此，在空气-缓冲液界面上的脂质单层被用来模拟精子膜外小叶的脂质结构域。这种方法被证明能有效地复制牛精子膜外小叶脂质结构域的异质结构域[35]。最后一种是主要的脂质成分，即鞘磷脂、胆固醇、1-棕榈酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（PC）和血浆卤素1-（1Z-十八烯基）-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（P-PC）。在这一单层中，胆固醇和鞘磷脂在34°C处由PC和P-PC的液体混合物包围，形成凝聚结构域◦C.LDL和脂质体在接近生物膜相关压力的情况下被引入单层下方的亚相[36]。通过监测表面积的变化来检测添加剂与单层膜之间的相互作用。最后，在相同的精子膜外小叶脂质模型和相同的条件下，比较了LDL和脂质体对BSP蛋白的隔离特性。

2、材料和方法

2.1.材料

主要构成重构膜外小叶的脂质购自Avanti Polar Lipides（美国阿拉伯斯特市阿拉伯斯特市），并按接收时使用。化合物1-棕榈酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（PC（16:0/22:6），分子量=806.1，纯度>99%）和1-（1Z-十八烷基）-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱PC（P-18:0/22:6，分子量=818.2，纯度>99%）作为氯仿溶液（10mg-mL）获得−1).将PC（16:0/22:6）和P-PC（18:0/22:6）的储备溶液稀释至1.25 mg mL−1解决方案。以绵羊毛胆固醇（Chol，Mw=711.0，纯度>98%）和鸡蛋鞘磷脂（SM，Mw=386.7，纯度>98%）为粉末。二者均以1.25 mg/mL的浓度溶解于氯仿（HPLC级，法国瓦尔德鲁伊尔Carlo Erba）−1.

低温保护培养基由Trizma碱（173.0 mM）、一水合柠檬酸（70.0 mM）、果糖（56.0 mM）、甘油（6.4%；v/v）和抗生素（青霉素G钠391 mg L）组成−1，硫酸链霉素856 mg L−1，盐酸林可霉素204 mg L−1，硫酸大观霉素四水合物585 mg L−1）（西格玛-奥尔德里奇，法国圣昆廷法拉维尔）。将pH值调整为6.2，其渗透压约为1300.0 mOsm。

2.2.低密度脂蛋白的提取

根据Moussa等人的方案，从蛋黄中提取低密度脂蛋白（LDL）[31]。提取后，将低密度脂蛋白浓缩提取物（22±0.5 g，相当于8.36 g干低密度脂蛋白）在低温保护介质（100 mL）中稀释。通过micro BCA蛋白质分析试剂盒（Pierce，Thermoscitific，France）对LDL样品中的蛋白质进行定量，得出8.9±1.0 mg-mL−1.LDL样品中PC磷脂的含量是根据鸡蛋中PC的自然比例（18.4 g PC/100 g干LDL）计算得出的，Givenbyonton等人[33]。它等于15.4克升−1份低密度脂蛋白样品。LDL也含有一小部分PE（PC/PE 6:1）[33]。

2.3.精浆收集

从一头Prim Holstein公牛身上收集牛精子，并立即以10000×g离心两次，以回收上清液中的精浆。我们样品的蛋白质含量为88.5±5.0mg-mL−1，由micro BCA蛋白质分析试剂盒（Pierce，Thermoscitific，法国）测定。

2.4.脂质体的制备

脂质体由冷冻保护缓冲液中的卵磷脂提取物通过使用Avanti Polar Lipides（美国阿拉巴马州阿拉巴马州阿拉巴马州阿拉巴马州阿拉巴马州）的微型挤出机挤出而制备。卵磷脂提取物由磷脂酰胆碱（73%）和磷脂酰乙醇胺（11%）以及甘油三酯和鞘磷脂等次要成分组成。提取物在低温保护缓冲液中水合过夜，脂质浓度分别为3.90 mg-mL−1（C1），7.28毫克/毫升−1（C2），14.56毫克/毫升−1（C3）和21.84毫克/毫升−1（C4）。然后在超声波浴中对分散液进行15分钟的超声波处理（Elmasonic S 30H，来自德国Singen Elma，功率为275W）。最后，在挤出机中挤出分散体（20次穿过100 nm的膜）。分布尺寸集中在120nm，Zeta电位值为−6毫伏。在BSP存在下引入的脂质体量以重量表示（脂质体分散体C1、C2、C3和C4分别为1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg和6.55 mg的脂质）。不确定度为0.01 mg。

2.5.电泳

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）在还原条件下进行。将精浆溶解在pH值为6.8的缓冲液中，该缓冲液由Tris 0.5 M、SDS 10%、甘油30%w/w和溴酚蓝0.4%组成，以获得1mg mL−1解决方案。添加9%巯基乙醇v/v，并旋转样品，随后在95℃下加热◦C 5分钟。然后，将10?L低范围分子量标准品（法国Souffelweyersheim Euromedex公司的试剂盒O6U-0511）和10至25?L精浆装入15%聚丙烯酰胺凝胶（pH 6.8-Tris 0.5 M和SDS 0.10%）中，并与由Tris 0.025 M、甘氨酸0.192 M和SDS 0.1%组成的pH 8.3迁移缓冲液耦合。在20 mA时进行电泳，并用考马斯蓝溶液G250对凝胶进行染色。最后对染色凝胶进行扫描，并使用Multi-Gauge软件（2.0版，日本富士照片胶片有限公司）评估峰值强度。

2.6.表面活性测量

吉布斯膜（由精浆溶液扩散到空气-缓冲界面形成）的表面张力在安装在朗缪尔天平（Microtoul XL-LB，Kibron Inc.，Helsinki，芬兰）上的15孔板（带特氟隆边缘的铝底多孔板）上测量，该天平配有高灵敏度传感器（使用合金丝的Wilhelmy方法）。该装置被放置在一个温度控制区，固定在23°C◦C，并用纯蒸馏水（美国密理博公司Milli-Q系统）校准。测量精度为0.1 mN/m。将精浆放入第一个孔中，然后在下一个孔中用因子2稀释，依此类推（每个孔的体积为300?L）。每种精浆提取物重复测量4次（n=2）。结果表示为所有测量的平均值。

蛋白质膜的压缩等温线是在之前配备传感器的朗缪尔槽（MicroTour XL-LB，Kibron Inc.，芬兰赫尔辛基）上测量的。精浆首先在冷冻保存缓冲液（1/100）中稀释，并在缓冲液表面逐滴（50?L）扩散。平衡20分钟后，在室温下（23℃）记录压缩等温线◦C）。

2.7.精子膜外小叶脂质结构域的重建

精子膜外小叶的脂质结构域如前所述重建[35]。朗格缪尔槽（302LL，NIMA技术，英国）被插入一个自制的手套箱上，放置在抗振动台上，用氩气冲洗，以避免脂质氧化。表面压力的测量精度为0.1 mN/m，使用滤纸制成的一块极板（英国肯特郡迈德斯通惠特曼国际有限公司生产的无灰惠特曼色谱纸）与电子天平相连。环境温度固定在20℃◦C.将所有烧瓶和注射器放入手套箱中，然后在摊铺单层之前用氩气将手套箱脱气1小时。朗缪尔天平的温度由设置为40℃的循环水系统进行恒温控制◦C.缓冲液表面的实际温度为34℃◦C.亚相由低温保护介质组成。以适当的摩尔比（31:14:16:39）将胆固醇、鞘磷脂、P-PC（18:0/22:6）和PC（16:0/22:6）的氯仿溶液用25?L微型注射器（精确到0.5?L）逐滴地分散到缓冲液亚相上（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzterland）。单层保持平衡10分钟，然后以40 cm2/min的屏障速度开始压缩。一旦达到目标压力（25 mN/m），通过调整可移动屏障的表面积保持压力恒定。由于单分子层在30 mN/m时不够稳定，这是与双层中脂质堆积密度相关的膜压力[36]，我们将目标压力降低到25 mN/m，其中单分子层更稳定（见结果）。

一旦达到目标压力（25 mN/m），将其保持1000 s，然后使用弯曲针管将生物分子（LDL、BSP或脂质体）溶液引入亚相。针头弯曲远离针尖，并位于槽的底部，以便在压缩的亚相下方进行注射。之前将当量体积（每种添加剂0.3 mL）移到屏障后面。注射生物分子后，监测每个脂质分子的面积变化，并表示为相对于初始值的变化（a/a=（a−A（t0）×100/A（t0）。它已经被跟踪了3000秒，相当于冷冻保存前处理精液的时间。在这种恒压模式下，生物分子插入脂质单层导致膜压力增加，而膜压力通过增加表面积而降低。相反，如果生物分子导致脂质单层溶解在亚相中，表面积就会减小。重复所有数据，偏差不超过表面积的5%。

2.8.低温透射电子显微镜（Cryo TEM）

使用低温插入式低温固定装置（美国加坦）制备用于低温TEM观察的试样，其中一滴水悬浮液沉积在辉光放电多孔型碳涂层格栅（美国Ted Pella公司）上。然后，通过将含有试样的液滴吸干到支撑碳膜孔上残留的薄层液体上，制备TEM网格。通过将格栅快速插入液氮冷却的液态乙烷中，使液膜玻璃化。玻璃化标本安装在Gatan 910标本架（美国Gatan）中，使用CT-3500-cryotransfer系统（美国Gatan）将其插入显微镜中，并用液氮冷却。然后从保存在玻璃质冰中并悬浮在支撑碳基质上的孔中的标本获得TEM图像。

在低剂量条件下观察样品（<10 e−/A2），在−178◦C、使用JEM 1230“Cryo”显微镜（日本Jeol），在80 kV电压下运行，并配备LaB6灯丝。所有显微照片均记录在Gatan 1.35K×1.04K×12位ES500W CCD相机上。为确保观察的良好重复性，从几个样品制备中采集了一系列超过50张的图像，放大率不同。