摘要

在这里，我们使用朗缪尔槽研究了乳清分离蛋白（WPI）和疏水蛋白HFBII在空气/水界面的扩散层和吸附层的表面膨胀特性，并将其与泡沫能力和稳定性联系起来。在扩散和吸附系统中，观察到模量随着HFBII在表面或本体中的分数逐渐增加，我们可以确定WPI主导和HFBII主导行为的不同区域。通过目视观察槽表面出现的微观皱纹，进一步证实了HFBII的优势。当比较扩散和吸附系统时，发现需要更高的HFBII分数才能在扩散层中获得HFBII主导行为，而不是吸附层（fHFBII分别为0.6和0.2）。此外，我们的结果表明，在连续的大规模压缩/膨胀循环中，HFBII对界面行为的贡献变得更加显着。为了解释这种非平凡的行为，我们建议在界面处形成多层结构，顶层富含HFBII，底层富含WPI。泡沫的粗化稳定性与吸附层的表面膨胀特性比扩散层的表面膨胀特性更接近。最后，观察到，在HFBII和WPI的混合体系中，粗化过程趋于平稳，这与HFBII在混合WPI:HFBII层中的主导地位随着收缩气泡表面发生的大表面变形而增加。

1.介绍

疏水蛋白是丝状真菌产生的一类具有高度表面活性的蛋白质。它们的生物学功能是介导（气生）菌丝、孢子和子实体的形成，在此过程中，亲水和疏水环境（即细胞材料和空气）之间形成一个大界面[1]。

疏水蛋白由100±25个氨基酸组成，具有8个半胱氨酸残基的特征模式，形成4个分子内二硫键[2]，使蛋白质分子非常紧密且坚硬。疏水蛋白的三级结构显示出明显的疏水区和亲水区[3-5]。根据其水溶性和亲水性模式，疏水蛋白可分为两类[4]。I类疏水蛋白是最具表面活性的，但水溶性很低，因此难以在实际应用中使用。II类蛋白的表面活性略低（与1类疏水蛋白相比，但与任何其他蛋白质类相比，仍然非常出色），并具有良好的水溶性。对于II类疏水蛋白，HFBII是小分子量（7.2 kDa）和4个二硫键的独特组合，可防止疏水部分重排到蛋白质核心，并使其暴露于周围介质中。因此，在水环境中，HFBII表现为天然Janus颗粒[4]，具有不同的亲水性和疏水性表面补丁，从而导致不同的两亲性行为以及本体和表面自组装。

最近，Cox等人[6]研究了HFBII的表面性质，并用其解释了简单气泡团中极低的空气溶解速率。在后续工作中，Cox等人[7]证明了HFBII可以用于生产液体泡沫，这种泡沫在几个月内保持稳定。因此，这些分子被描述为空气结构蛋白。这种稳定性是异常的，因为在大多数情况下，液体泡沫会通过歧化过程稳定地变粗[7,8]。正因为如此，人们往往依赖于体积弹性来稳定泡沫，从而限制了应用量，例如面包、冰淇淋或慕斯和巴瓦罗甜点[9]。

现在，HFBI稳定化泡沫中歧化的异常稳定性可以用非凡的表面性质来解释：HFBII具有极高的解吸能，它看起来是一种致密、坚硬且粘性的颗粒[8,10]。因此，HFBII表层在振荡和稳定膨胀状态下都具有出色的表面剪切和膨胀模量[8,11]。此外，它们在持续压缩时显示出褶皱形成，这与表层的弯曲弹性有关[10]。

当将这些空气结构蛋白应用到消费品中时，它们几乎不可避免地会遇到其他同样具有表面活性的成分，例如蛋白质。例如，众所周知，混合蛋白质和/或乳化剂系统的表面性质可能与纯系统的表面性质截然不同，这可能导致乳液或泡沫的稳定或不稳定[12–14]。最近，关于HFBII和-酪蛋白混合层的表面剪切流变学的数据也已公布，为此类层的分层提供了详细的假设[15]。

为了探索其他蛋白质对HFBII作为泡沫歧化稳定剂的功能性的影响，本文致力于HFBII和乳清分离蛋白（WPI）的混合体系。在WPI中，主要蛋白质是-乳球蛋白：一种具有代表性且经过充分研究的球状食品蛋白质，分子量约为18 kDa，等电点为5.1，在吸附到界面时能够展开[8,16–20]。

该研究的目的是将已知成分的混合层的行为与混合物的发泡行为关联起来。为此，我们选择了三个步骤来接近这些极限：第一步是研究HFBII:WPI水溶液混合物层的膨胀表面性质，这些混合物分布在纯空气/水界面上，从而确定界面处蛋白质的初始组成。由于这两种蛋白质都相对较大（它们是大分子），并且具有显着的表面活性和附着能，因此预计不会有（或不可逆的）蛋白质脱附到整体上。因此，在压缩/膨胀循环期间，蛋白质浓度和组成预计保持不变。在第二步中，我们使用吸附系统，制备具有已知体积组成的两种蛋白质的水溶液，并使该系统在空气/水中自发吸附，并与体积平衡。很明显，在这种情况下，由于蛋白质对界面的亲和力不同，体积和表面成分可能不同。当我们开始压缩/膨胀循环以探索表面膨胀流变学时，由于多种原因，表面成分也可能发生变化。在膨胀循环期间，蛋白质可能在表面积聚，在界面和表面下重新排列，可能形成多层，在压缩循环期间，蛋白质解吸的程度要低得多。因此，在这一过程中，系统可以在顶层富集最具表面活性的蛋白质，而在界面下方可能形成第二层的表面活性较低的蛋白质则被耗尽。此外，为了将这些与歧化稳定性联系起来，我们选择应用大变形膨胀流变学，并已建立和验证了歧化的理论联系[8,9,21]。我们的最后一步是评估混合蛋白质溶液的泡沫形成和泡沫歧化稳定性，并尝试将泡沫特性与吸附层和铺展层的表面膨胀流变性相关联。

2.材料和方法

2.1.材料

II类疏水蛋白HFBII（分子量7200 Da）从芬兰VTT生物技术公司获得，并从里氏木霉中提取[22,23]。储备溶液储存在冰箱中，使用前解冻、稀释并在超声波浴中处理30秒。在朗缪尔槽实验中，乳清蛋白分离物“Bipro”来自Davisco（美国），其中大部分（约50 wt%）为乳球蛋白。黄原胶Ketrol RD是从CPKelco（美国圣地亚哥）购买的。

2.2.方法

2.2.1.使用朗缪尔槽的小变形和大变形膨胀表面流变学

对于空气/水表面的表面膨胀流变学实验，我们使用了Kibron Inc.（芬兰埃斯波）生产的MicroTroughX Langmuir槽。席胡氏的尺寸为230×55毫米（A＝11800平方毫米），亚相体积约为15 mL。表面张力是用超灵敏的KiBron传感器、小直径（0.51毫米）特殊合金丝在槽的中部测量的。灵敏度优于0.01mn/m。

对于扩散系统，制备了1 mg/ml HFBII和1 mg/ml WPI的储备溶液，并按不同的混合比例混合。广泛清洁朗缪尔槽后，向槽中注入约15毫升清洁去离子（微孔）水，在真空下脱气，屏障设置为3000 mm2。用注射器清洁屏障之间的界面后，表面扩大到10000 mm2。将表面张力探针应用于界面并进行校准。使用干净的10μl带针头的玻璃微注射器，将约2μl的等分蛋白质溶液涂抹在表面的几个点上，直到涂抹总体积为15μl。在传播蛋白质的同时，表面压力通常上升到大约1到3 mN/m。在平衡表面15分钟后，以5 mm/min的线速度将面积压缩至3000 mm2，同时记录表面张力随时间的变化。随后，使用滞后函数，在5至30 mN/m的表面压力之间（或根据系统允许的范围进行微调）施加5次膨胀-压缩循环。对于混合体系，每个分子的面积定义为槽面积除以所有WPI和HFBII分子的总和，并按其应用的质量进行称重。从吸附层上拍摄照片，可以看到褶皱的形成。

为了进行吸附实验，制备了0.1 mg/ml HFBII和0.1 mg/ml WPI的储备溶液，并将其混合到几种混合比例。广泛清洁朗缪尔槽后，用5毫升移液管小心地在3000 mm2的屏障之间填充20毫升蛋白质溶液。请注意，它试图从屏障外部填充，以确保屏障内部的初始界面干净，但HFBII的存在会在穿过屏障时产生褶皱。用注射器清洁屏障内部的界面后，表面以140 mm/min的速度膨胀至10000 mm2，同时记录表面张力。然后让表面堆积1000 s，然后以5 mm/min的线速度压缩至3000 mm2。再次膨胀至10000 mm2后，在表面压力的最大可能范围（例如，纯HFBII为20–40 mN/m，纯WPI为15–25 mN/m）之间开始5个周期的滞后函数。

使用内部开发的软件工具计算膨胀模量。该工具首先通过使用N阶切比雪夫多项式对测量的П-A曲线进行分割和平滑，从而对其进行粗略的缩减。然后使用解析样条导数表达式对模量进行数值计算，使我们能够计算沿实验П–A曲线的任意点处的膨胀模量。

2.2.2.发泡实验

250毫升烧杯装有偏心轴，以支撑磁性搅拌装置Nespresso Aeroccino milk frothing whisk（荷兰当地商店购买），该装置与恒压直流电源相连，以避免因电池放电而导致功率和再现性损失。

在泡沫实验中，制备了1 mg/ml HFBII和1 mg/ml WPI的储备溶液。将储备溶液在烧杯中按所需比例混合，使总样品体积为100 ml。在1600 rpm下搅拌样品6 min。由于泡沫产生后粘度增加，搅拌器偶尔会从主轴上跳下，但速度始终达到1500–1600，持续6分钟，但有时会中断。排水1分钟后发现溢出。将20 ml泡沫层样品与0.5%黄原胶溶液混合至50%的气相体积，并使用Turbuscan（TLab Expert，Formulation，Toulouse，France）[8]实时跟踪气泡大小的变化约48小时。