3.结果

3.1.体外抗癌能力和选择性

G（IIKK）nI-NH2（n¼1e4）肽是通过Fmoc固相肽合成协议[9e11]合成的。CD研究表明，这些肽主要存在于缓冲溶液中的无序结构中。在添加到DPPG（二棕榈酰磷脂酰甘油）SUV（模拟带负电荷的细菌和癌细胞膜的小单层囊泡）中后，除了GIIKKI-NH2外，肽采用a-螺旋构象。两亲螺旋结构有利于它们与脂质双层的相互作用，但GIIKKI-NH2始终保持未折叠状态，无论周围环境发生任何变化。二级结构的这种缺乏变化与其缺乏生物活性很好地一致。随后的细胞研究集中于n¼2、3和4的系列。

按照浓度依赖性模式，重复次数较多或长度较长的肽在杀死癌细胞（HeLa和HL60细胞）方面更有效，但对正常细胞（红细胞和HDFa细胞）的体外毒性也开始增加，如图1aec所示。总的来说，就体外抗癌活性和细胞选择性而言，G（IIKK）3I-NH2是最佳序列，其对HeLa和HL60细胞的IC50值为15和25 mM，EC50远大于250 mM（IC50：浓度导致50%的癌细胞生长抑制；EC50：浓度诱导50%的红细胞溶解）。重要的是，HDFa细胞对这些肽有良好的耐受性，例如，在浓度低于50 mM时，G（IIKK）3I-NH2对HDFa细胞的影响微不足道（图1c）。我们合理设计的短肽的这种性能明显优于天然AMP，如马盖宁和蜂毒素，并且在有效性、选择性甚至耐药性方面也优于抗癌药物顺铂[12e15]。例如，在类似的实验条件下，magainin-2对HeLa细胞的IC50低于60 mM，而蜂毒肽在5 mM下的EC50则低得多，显示出对宿主细胞的高毒性[12e14]。

图1。设计的a-螺旋肽的细胞毒性和选择性。（a）对HeLa和HL60细胞的细胞毒性。（b）人类红细胞溶血。（c）对HDFa细胞的细胞毒性。（d）FITC-G（IIKK）3I-NH2在含有HL60癌细胞和HDFa原代细胞的体外共培养系统中的分布。

然后，我们进一步评估了基于体外共培养系统的细胞选择性，该系统包含HL60癌细胞和HDFa原代细胞，它们与体内环境非常相似[8]。将最终浓度为20 mM的FITC-G（IIKK）3I-NH2添加到系统中，培养1 h后，用荧光显微镜观察两种细胞中的肽分布（图1d）。很明显，绿色荧光集中在悬浮和圆形HL60细胞中，而不是粘附和纺锤形HDFa细胞中，这再次表明肽具有良好的细胞选择性，以及对癌细胞的快速识别。

3.2.肽与脂质单层的选择性相互作用

在这个阶段，这些肽的选择性背后的机制过程在很大程度上仍不清楚，但抗癌肽主要是膜活性的，它们对癌细胞的作用方式涉及膜破坏。此外，它们对癌细胞的选择性杀伤与癌细胞的两个关键细胞膜特征密切相关，即净负表面电荷和更大的膜流动性[2,3,16]。为了了解肽和细胞膜之间的特殊相互作用以及分子水平上抗癌作用的基本过程，我们转向使用脂质单层的膜模型。图2a显示了在最终浓度为3 mM的条件下，将G（IIKK）（2e4）I-NH2注入亚相时，DPPC（二棕榈酰磷脂酰胆碱）和DPPG单层（分别模拟正常哺乳动物宿主细胞和癌细胞外膜）的表面压力从不同的初始表面压力（pi）增加（Dp），同时保持表面积不变。所有的肽都表现出对带负电荷的DPPG单层的明显偏好，而对两性离子DPPC单层的亲和力则要小得多。在Dp¼0处对每个压力图进行外推，得出排除压力，超过该压力，肽不再能够穿透脂质单层，从而导致表面压力进一步增加。对于两性离子DPPC单层，G（IIKK）2I-NH2的排斥压力为23.4 mN/m，远低于生物膜的30e35 mN/m生理范围[17,18]，这与其对红细胞的毒性很小相符。相比之下，G（IIKK）（3e4）I-NH2的值分别增加到32.0和37.6 mN/m，这与它们的溶血活性增加一致。另一方面，对于带负电荷的DPPG单层，排斥压力分别显着增加至37.3、40.6和42.6 mN/m，表明阳离子肽电荷和阴离子脂质头基团之间的静电相互作用起着关键作用。尽管DPPC和DPPG单分子膜对G（IIKK）2I-NH2的排斥压差较大（参见补充数据，图S1），但其对后者的排斥压仅略高于生物膜30e 35 mN/m的生理范围，这与其杀死癌细胞的效率较低一致，因此，这种肽在癌症治疗中没有吸引力。另一方面，G（IIKK）4I-NH2对两性离子DPPC单分子膜的排斥压力为37.6 mN/m，略高于30e35 mN/m的生理范围，这与该系列中表现出的最高溶血能力一致。G（IIKK）3I-NH2显示出中间值，DPPC单层的Dp值为32.0 mN/m，DPPG单层的Dp值为40.6 mN/m，这与体外细胞工作中的最佳细胞选择性一致。

图2。肽与不同脂质单层的相互作用。（a）当肽以3 mM浓度注入亚相时，在不同初始表面压力（pi）下，DPPC和DPPG单分子膜的表面压力增加（Dp）。（b）将G（IIKK）3I-NH2注入DPPC和POPC单分子膜的亚相后的表面压力与时间的关系。

癌细胞中胆固醇水平的降低和具有不饱和脂肪酰链的脂质的增加可能是膜流动性增加的原因[19]。将最终浓度为3 mM的G（IIKK）3I-NH2注入亚相后，饱和DPPC和不饱和棕榈酰油酰磷酰胆碱（POPC）单分子膜的平衡表面压力增加趋于3.5和10 mN/m，初始表面压力为30 mN/m（图2b），表明无论膜电荷相互作用如何，增加的膜流动性确实有利于表面活性肽的膜渗透。

3.3.肽的原位定位和质膜完整性

为了在与HeLa细胞孵育期间精确定位抗癌肽，使用浓度为10 mM的FITC-G（IIKK）3I-NH2，并使用激光共聚焦显微镜观察其在这些细胞中的荧光分布，与孵育时间有关。孵育1小时后，大部分FITC衍生信号（绿色（网络版））位于HeLa细胞膜上，在细胞质内观察到相对较弱的荧光信号（图3a），表明细胞周围的膜是这一时期的主要靶点。然而，孵育24小时后，荧光信号在细胞内积累（图3b），表明肽穿过外脂双层的易位。此外，处理24小时后，细胞边界变得明显模糊，这可能是因为在此过程中细胞膜的结构逐渐退化。因此，人们很好地预期，在易位后，肽会与细胞内靶点（如线粒体）相互作用，触发细胞凋亡。

图3。肽的原位定位和质膜完整性。（a）用10mM FITC-G（IIKK）3I-NH2孵育1h后HeLa细胞中的肽位置。（b）用10mM FITC-G（IIKK）3I-NH2孵育24h后HeLa细胞中的肽位置。（c）未经处理的HeLa细胞的代表性SEM显微照片。（d）用10mM G（IIKK）3I-NH2处理24小时的HeLa细胞的代表性SEM显微照片。

为了确定与肽结合后的膜通透性，我们进行了钙黄绿素AM释放试验。与10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育10 min导致约20%的钙黄绿酸从HeLa细胞中释放，表明其对癌细胞膜的快速渗透作用（参见补充数据，图S2）。正如预期的那样，增加培养时间会导致更多的膜通透性，在培养6小时后，钙黄绿素AM的释放超过40%。在较短的培养时间内，明显的膜通透性与上述观察到的肽与癌细胞膜的快速结合非常一致。

为了直接观察G（IIKK）3I-NH2对细胞形态的影响，特别是在大多数肽分子转移到膜上的较长培养时间后，我们进行了SEM检查。未经处理的HeLa细胞显示出正常的光滑表面，相邻细胞之间具有良好的细胞间接触（图3c）。相比之下，用10 mM G（IIKK）3I-NH2处理24小时的HeLa细胞在细胞形态上表现出明显的改变（图3d）。观察到收缩的细胞膜明显破裂和溶解。除了细胞膜损伤外，一些处理过的细胞表现出严重的表面起泡（图3d的右图），这是细胞凋亡执行阶段的特征性事件[20]。

3.4.细胞凋亡

由于肽易位到细胞质中，并且治疗后的癌细胞出现了凋亡形态学，我们随后遵循了细胞凋亡的几个关键生化和形态学特征，旨在将凋亡诱导与HeLa细胞死亡联系起来，并揭示可能的凋亡途径。

3.4.1.核形态变化与DNA断裂

染色质凝聚与DNA片段化平行是用于识别细胞凋亡的可靠标准[21]。通过对细胞进行DAPI染色，我们首先比较了在37C温度下用10 mM G（IIKK）3I-NH2处理24小时前后HeLa细胞的细胞核变化（图4a）。未经处理的HeLa细胞的细胞核形态规则且完整，弥漫性DAPI染色。相反，随着荧光强度的增加，肽处理的细胞核形状发生改变，染色质聚集成不规则的致密团块。此外，在不同的培养时间从处理过的HeLa细胞中提取基因组DNA，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。孵育12小时后，出现寡核苷酸大小的DNA片段，并且随着孵育时间的增加，模式变得更加明显（图4b）。相比之下，从未经处理的HeLa细胞中分离的DNA条带是单一的，没有发生DNA断裂。有人提出，一旦染色质完整性受损，一些激活酶（如内源性核酸酶）负责将染色质DNA切割成180e200 bp的片段及其整数倍[22e 24]。

图4。细胞凋亡的生化和形态学特征。（a）HeLa细胞与10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小时前后的DAPI核染色。（b）HeLa细胞与10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育后提取的基因组DNA的凝胶电泳分析。（c）在与10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小时之前和之后，用FITC phalloidin对HeLa细胞进行F-肌动蛋白染色。

3.4.2.细胞骨架改变

肌动蛋白细胞骨架在介导细胞对内部和外部信号的反应中起着至关重要的作用[25]。它有一个动态结构，具有独特的形式，适用于运动、粘附、分裂和细胞死亡等特定任务[26e28]。异常F-肌动蛋白动力学的发生与细胞凋亡的发展密切相关，通常伴随着ROS的线粒体释放[28]。在与10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育之前和之后，用FITC phalloidin对HeLa细胞进行染色，以显示F-肌动蛋白（丝状肌动蛋白）。对于未经处理的细胞，纤细的微丝束平行于细胞的长轴，而F-肌动蛋白随着处理的细胞变得紊乱和缩短（图4c）。

3.4.3.线粒体途径

线粒体在细胞凋亡中起着核心作用，凋亡死亡中的许多关键因素和事件都受其调控。一些凋亡蛋白可以靶向线粒体，通过形成膜孔或增加线粒体膜通透性导致线粒体肿胀。这两个过程都允许释放凋亡效应器[29e32]。在这项工作中，成功地观察到线粒体途径与细胞凋亡有关。我们首先以JC-1为探针，观察线粒体膜电位的变化[33]。未经处理的HeLa细胞显示线粒体橙红色荧光和少量绿色荧光（网络版）。与10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小时后，绿色荧光占主导地位（图5a），表明线粒体膜电位显着丧失。线粒体膜电位的这种去极化通常伴随着线粒体膜通透性的增加和Cyt c的释放[34]。然后，我们进行了免疫荧光成像，该成像显示未经处理的细胞中Cyt c的清晰、颗粒状染色模式，与G（IIKK）3I-NH2处理的细胞中Cyt c的更弥散染色形成对比（图5b）。这种差异表明细胞色素c从线粒体释放到细胞质中，与观察到的线粒体膜电位去极化高度一致。在细胞质中，释放的Cyt-c可以在dATP存在下诱导Apaf-1和caspase-9之间的相互作用，从而进一步激活caspase级联反应并触发细胞凋亡[35]。

图5.图5。线粒体功能障碍与Fas-FasL通路。（a）用10mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小时前后HeLa细胞的JC-1线粒体膜电位染色的荧光图像。（b）用10mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小时前后HeLa细胞的Cyt c免疫荧光染色。（c）Caspase-8，与10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育后HeLa细胞的fas-L和fas基因转录。

3.4.4.死亡受体途径

线粒体调节的细胞凋亡可通过其他受体相关途径放大，如Fas与其配体（Fas-L）的相互作用[36]。为了研究该肽是否启动了死亡受体途径，我们进行了实时PCR分析，以分析相关基因转录（caspase-8、fas和fas-L）。10mM G（IIKK）3I-NH2处理的HeLa细胞在3至6h内的caspase-8转录水平明显升高，而在孵育12h后急剧下降至正常值。fas和fas-L的转录遵循相同的趋势（图5c）。两个基因（fas和fas-L）的高表达增加了它们相互作用的机会。这两种分子的结合诱导了死亡诱导信号复合物（DISC）的形成，其中含有半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10[36,37]。Fas圆盘启动了一个反馈回路，螺旋上升，增加了线粒体促凋亡因子的释放和caspase-8的放大激活[38]。另一方面，半胱天冬酶-8诱导的凋亡也可以通过刺激线粒体释放Cyt c来放大[39]。在G（IIKK）3INH2处理的HeLa细胞中，死亡受体通路基因的高转录意味着该肽诱导的细胞凋亡也参与了死亡受体依赖的方式。

3.5.免疫效应

从活生物体中分离的天然抗菌肽在临床上的应用非常有限，因为它们的生产成本高、溶血性高以及可能的免疫效应[16]。除了通过高细胞选择性降低生产成本和溶血作用外，所设计的螺旋肽的非免疫效应对于开发其潜在应用也至关重要。两个细胞因子基因IL2和IL8被认为是主要的免疫系统信号分子，它们能够对微生物感染做出反应，并将外来分子（非自身）与人体自身细胞和分子（自身）区分开来[40,41]。因此，这两个基因的高表达通常会诱发急性和慢性炎症。因此，在用肽G（IIKK）3I-NH2处理人类淋巴细胞后，使用RT-PCR分析其细胞因子基因IL2和IL8的转录水平。如图S3所示，肽培养后淋巴细胞的IL2和IL8的相对转录水平低于或几乎等于相应对照组的水平，表明G（IIKK）3I-NH2与淋巴细胞的相互作用不会诱导非特异性免疫原性反应。

3.6.体内抗肿瘤性能

将人宫颈癌HeLa细胞接种于裸鼠皮下。肿瘤植入5天后，分别以1.5 mg/kg和5 mg/kg的剂量腹腔注射肽G（IIKK）3INH2和G（IIKK）4I-NH2。在给药期间，未观察到任何毒性迹象，如体重减轻和外观不良（图6b），尽管G（IIKK）4I-NH2显示出更高的体外溶血性。与PBS中的阴性对照相比，这两种肽对肿瘤生长表现出明显的抑制作用，其中G（IIKK）4I-NH2表现出比G（IIKK）3I-NH2更好的疗效（图6c），这与它们的体外抗肿瘤趋势一致。18天后，解剖肿瘤并称重（图6a和d）。在1.5 mg/kg和5 mg/kg剂量下，G（IIKK）3I-NH2治疗组的肿瘤生长抑制率分别为0.23和0.31。G（IIKK）4I-NH2能产生更有效的抑制作用，在1.5 mg/kg和5 mg/kg剂量下，抑制率分别为0.32和0.41。这些数据表明，在小鼠异种移植模型中，螺旋肽可以有效地抑制肿瘤生长，而肿瘤细胞不能被完全清除。许多抗肿瘤药物的不完全抑制作用已被广泛观察到，这可归因于多种机制，例如药物从肿瘤部位相对较快地清除，以及它们难以通过坏死区域扩散[42]，但目前这组肽背后的确切原因有待进一步的机理研究。

图6。人宫颈癌裸鼠移植瘤的体内抗肿瘤作用。（a）给药后解剖肿瘤。（b）给药期间体重变化。（c）给药期间肿瘤体积的变化。（d）给药后的肿瘤抑制率。

4.讨论

这些设计的肽短而规则。与典型的天然AMPs和流行的抗癌药物顺铂相比，它们在抑制癌细胞生长方面的结构简单、效力高、副作用小，使它们成为基础研究和应用研究的理想模型和靶点。这些肽在界面性质和生物活性方面表现出系统性的变化。我们面临的直接挑战是如何将分子结构设计、界面性质和破坏细胞膜的选择性联系起来。这代表了功能性生物材料研究的核心努力，从而在未来肽抗生素的合理设计和对其抗肿瘤性能的理解中获得更好的分子洞察力。

我们之前在共培养环境下使用NIH 3T3细胞系作为宿主细胞的研究表明，这些肽对细菌和癌细胞的作用模式大致相似，并解释了为什么它们不会对正常哺乳动物细胞造成伤害[8]。由于磷脂酰丝氨酸、O-糖基化粘蛋白、唾液化神经节苷脂和硫酸肝素的表达升高，肿瘤细胞膜也携带净负电荷。这种外膜表面的负电荷特征与细菌非常相似。这些肽和靶膜之间的静电相互作用对选择性反应至关重要。

在所研究的短肽系列中，G（IIKK）3I-NH2代表了体外抗癌活性和细胞选择性方面的最佳链长，与之前报道的抗菌活性和选择性观察结果一致。已经证明，对细菌和癌细胞的共同区别反应源自肽通过静电相互作用和疏水效应之间的平衡对不同细胞膜的选择性反应。具体而言，负表面电荷和高度不饱和脂链驱动的对癌细胞的高亲和力导致G（IIKK）3I-NH2与癌细胞膜的快速结合，并随后导致膜通透性。肽分子随后通过脂质双层转移，并积聚在癌细胞内部。这一过程产生了一系列细胞凋亡的形态学和生化特征，表明肽处理的癌细胞因膜破坏和凋亡而死亡。此外，这项工作还揭示了肽诱导的癌细胞凋亡与两个特征性的分子过程有关：线粒体途径和死亡受体途径。

这些肽在与淋巴细胞相互作用后不会诱导非特异性免疫原性反应，重要的是，它们在裸鼠体内对异种移植物显示出相当大的生长抑制作用，对宿主毒性很小，因此表明它们在临床开发中具有巨大潜力。这些数据共同构成了设计具有优异生物相容性和选择性的短肽生物材料的新范例的基础。迄今为止，许多AMP通过从天然蛋白质和肽中提取氨基酸序列来强调仿生作用。相比之下，在目前的工作中，我们采用了IIKK序列模块基本单元的最小模拟，然后采用人工重复（n）和选择性终端阻断，从而大大提高了性能。未来的工作可以评估仿生学如何与合理的结构设计相协调。目前尚不清楚一级序列的变化，例如用L、V和A替换I，或用R替换K，以及任何带有短侧链的非天然阳离子氨基酸，将如何改变效力和选择性。

另一方面，虽然短肽对不同细胞类型的选择性反应符合实验观察结果，但细胞外膜表面精细而复杂。目前基于选择性静电相互作用的解释充其量只能是一种简化的合理化。需要进一步研究，通过不同层次的模型界面表示来揭示详细的分子过程，从而更直接地了解不同细胞和亚细胞界面上的不同相互作用。因此，目前的工作为探索新的科学理解开辟了一系列具有挑战性但令人兴奋的实验机会。结合短设计功能肽开发相关的模型生物界面将促进新的实验能力，包括各种表面和界面成像、反射和散射，使用激光、x射线和中子束源。这些实验不仅将增加对生物界面过程的新理解，还将催生新技术。最后，之前的研究表明，表面活性剂样短肽（如A9K）在抑制癌症生长方面也表现出很高的效力和选择性[11]，但这些肽促进了水和膜样环境下的b-折叠构象，而不是本研究中报道的a-螺旋构象。目前还不清楚如何不同的二级结构可能导致等效的高效力和选择性，但具有明确的分子结构奠定了一个有用的基础，为我们探讨这些重要的差异，在未来的研究。对于从事跨学科研究的物理学家和材料研究人员来说，这些合理设计的模型比已经报道的各种天然AMP和同系物更易于处理。无论争论的方向和结果如何，这些短肽都将引起广泛的兴趣来探索其功能用途。效力的变化有不同的含义。例如，很短的肽可以用于皮肤护理，而较长的、效力更大的肽可以用于治疗开发。

5.结论

在一系列短肽G（IIKK）nI-NH2（n¼1e4）中，G（IIKK）3I-NH2代表了体外抗癌活性和细胞选择性方面的最佳链长，与之前在抗菌活性和选择性方面的观察结果一致。已经证明，对细菌和癌细胞的共同鉴别反应源于肽通过静电相互作用和疏水效应之间的平衡而产生的选择性反应。具体而言，负表面电荷和高不饱和脂链驱动的高亲和力导致G（IIKK）3I-NH2与癌细胞膜的快速结合和随后的膜通透性。然后，肽分子通过脂质双层转运，并在癌细胞内部积聚。这一过程产生了一系列细胞凋亡的形态学和生化特征，表明肽处理的癌细胞因膜破坏和凋亡而死亡。此外，这项工作还揭示了肽诱导的癌细胞凋亡与两个特征性的分子过程有关：线粒体途径和死亡受体途径。最后，该肽在与淋巴细胞相互作用后不会诱导非特异性免疫原性反应，重要的是，这些设计的肽在异种移植模型中显示出相当大的体内抗肿瘤作用，而毒性很小，这两者都表明它们作为功能材料在生物技术和临床应用中的潜力。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金资助31271497,30900765号和21033005号，山东省自然科学基金（ZR2009 9DQ00 1和JQ201105）和中央大学基础研究基金（12CX04052A）的资助。我们还感谢英国工程和物理科学研究委员会（EPSRC）的支持。我们感谢英国皇家学会（伦敦）为HX提供中英奖学金。