材料和方法

2.1. 酒样

分析了 20 种单品种、白葡萄酒和红葡萄酒。 他们包括来自白葡萄品种的样本：Tsaousi（W1、W2、W3、W4、W5）、Robola（W6、W7、W8）、Lagorthi（W9、W10）、Sideritis（W11、W12）、Tourkopoula（W13） ) 和红色 V. vinifera 葡萄品种：Augoustiatis (R1, R2)、Refosco Rosso (R3, R4)、Mavrodafni (R5, R6)、Vertzami (R7)，栽培于希腊西部。 相应地，葡萄酒是使用相同的酿造协议生产的，白色或红色。

2.2. 其他材料

牛血清白蛋白 (BSA) 购自 Acros Organics (NJ, USA)，L-(+)-酒石酸购自 Riedel-de Hae¨n (Seelze, Germany)，苹果酸、乳酸和柠檬酸购自默克 (Darmstadt) ， 德国）。 KCl、NaCl、MgCl2.6H2O、CaCl2.2H2O、甘油，以及标准化合物 (+)-儿茶素、没食子酸、乙醛、乙酸乙酯、甲醇、丙醇-1、甲基-2-丙醇-1、甲基- 2-丁醇-1、甲基-3-丁醇-1 和甲基-4-戊醇-2 来自 Sigma-Aldrich 化学公司（美国威斯康星州）。 缓冲溶液（pH 7.00 ± 0.02 和 pH 4.01 ± 0.02）来自 Mettler-Toledo。 无水乙醇、甲醇（99.8%，UV-IR-HPLC）、甲酸（98%）和盐酸（37%）来自 Panreac Quimica SA（西班牙）、硝酸（65%）、磷酸（85%、 ACS-ISO)、硫酸 (95–97%)、氢氧化钠、碘 (FIXANAL)、淀粉、EDTA 和磷酸二氢钾来自 Riedel-de Haen (Seelze, Germany)。 考马斯亮蓝 G250、(-)-表儿茶素、阿魏酸、咖啡酸和对香豆酸来自 Fluka (Buchs, Switzerland)。 花青素购自 Extrasynthese (Genay, France)。 葡萄籽和皮单宁（Tanipepin 和 Taniraisin）的商业提取物来自 Martin Vialattenologie（法国埃佩奈）。 HPLC 中使用的水由 MilliQ 水系统获得，最小电阻为 18.2 MV cm。

2.3. 模型解决方案

制备浓度为 8% 至 16% (v/v) 的乙醇水溶液，以匹配葡萄酒范围。 三组含有 BSA 蛋白或商业单宁的溶液制备在：(a) 水中，(b) 12% (v/v) 乙醇溶液和 (c) 模型葡萄酒溶液。 模型葡萄酒溶液由水/乙醇混合物 (88:12%, v/v) 和 2 g/L 酒石酸组成，pH 值通过添加 2 MNaOH 调节至 3.5。 研究的浓度为 0.025、0.100、0.250、0.500、0.750 和 1.000 克 BSA/L，以及 0.1、0.5、1.0、2.0 和 4.0 克丹尼皮平或丹宁菌素/L。

2.4. 方法

2.4.1. 表面张力测定

使用 Wilhelmy Constant Run 程序，通过 Wilhelmy 板法（自动 KSV Sigma_70 张力计，赫尔辛基，芬兰）在 25 度下进行表面张力测量。 结果表示为 mN/m，是三次重复分析的平均值。 获得的相对标准偏差 (%) 低于 5%。

2.4.2. 分析测定

基本酿酒参数：乙醇含量（% vol.）、可滴定酸度（g 酒石酸/L）和挥发性酸度（g 乙酸/L）、pH 值和还原糖（g/L）通过傅立叶变换确定红外光谱 (FTIR) 技术，使用 FOSS 自动分析仪（WineScanTM FT120 Basic，丹麦）。 量化基于校准曲线，该曲线使用从大量希腊品种葡萄酒分析中获得的数据建立。 根据国际葡萄与葡萄酒组织 (1990) 快速方法测定总 SO2 (mg/L)。 所有分析均一式两份进行。 重复性的相对标准偏差 (RSD %) 低于 10%。

总酚指数和单宁：总酚指数在 280 nm 处测定（Somers，1975；Sudraud，1958），而 Glories 方法（1978）用于测定单宁。 Shimadzu UV-1601 分光光度计（日本京都）结合 UVPC-1601 软件用于所有 UV-vis 吸光度测量。 所有分析均一式两份进行。 重复性的相对标准偏差 (RSD %) 低于 10%。

蛋白质：布拉德福德方法（布拉德福德，1976 年）用于测定蛋白质（Moreno-Arribas 等人，2002 年；Esteruelas 等人，2009 年）。 所有分析均一式两份进行。 重复性的相对标准偏差 (RSD %) 低于 10%。

通过 HPLC 测定有机酸、阳离子和甘油：使用 Waters HPLC 机器，该机器由 Waters 510 泵和带有 20 mL 定量环的 Rheodyne 7725i 型进样阀组成。 在分析之前，将样品通过 0.45 Millipore 过滤器过滤并通过 Sep-Pak C18 小柱（Waters，美国）进行纯化。

酒石酸、苹果酸、乳酸和柠檬酸的分离在 250 mm ? 4.6 毫米内径，5 毫米； PrevailTM Organic Acid column (Alltech Associates, Inc., Deerfield, USA) 根据 OIV (1990)。 对于检测，使用设置为 210 nm 的 Waters 996 光电二极管阵列检测器。 洗脱系统由 25 mM KH2PO4 溶液（pH 2.5）组成； 流速为 1.5 mL/min，进样量为 20 mL。 四种有机酸的七点校准曲线用于定量。

钾、钠、镁和钙的分离在 150 mm ? 3.9 毫米内径，5 毫米； IC-Pak Cation M/D 柱（Waters，美国），根据 Theodoridis (1997) 的方法在等度条件下进行。 检测使用 Waters 431 电导检测器。 洗脱系统由 0.1 mM EDTA 和 3 mM HNO3 溶液组成。 流速为 1 mL/min，进样体积为 20 mL。 四种阳离子的七点校准曲线用于定量。

甘油的分离在 150 mm * 7.8 mm id, 7 mm 上进行； 根据 Zoecklein 等人所述的方法，IC-PakTM 离子排阻柱（Waters，美国）在 60 ℃下恒温。 (1995)。 对于检测，使用 Waters 410 示差折光检测器。 洗脱系统由等度条件下的 0.005 M H2SO4 溶液组成。 流速为 0.5 mL/min，进样体积为 20 mL。 使用甘油标准溶液的七点校准曲线进行定量。

所有分析均一式两份进行。 通过分析通常在葡萄酒中发现的两种不同浓度的五种加标模型葡萄酒溶液来评估方法的重复性。 所有化合物的相对标准偏差 (RSD %) 均低于 10%。

酚类化合物的 HPLC：根据 Van De Casteele 等人的方法，使用带有 PDA 检测器的 HPLC 测定单个酚类化合物（儿茶素、表儿茶素、没食子酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸和花青素）的浓度. (1983)。 为了量化，酚类化合物的标准溶液以通常在葡萄酒中发现的浓度范围内的浓度使用。 结果表示为mg咖啡酸当量/L。 所有分析均一式两份进行。 所有化合物的重复性相对标准偏差 (RSD %) 均低于 8%。

GC-FID 检测挥发性化合物：将含有 50 mL 4-甲基-2-戊醇 (10 g/L) 水醇溶液作为内标的葡萄酒样品 (5 mL) 直接注射到 Carlo Erba（GC 8000 系列）上配备火焰离子化检测器 (EL 980) 和 50 m * 0.32 mm 内径、0.20 mm CPCarbowax 400 (Varian Inc., USA) 毛细管柱的气相色谱仪。 烘箱温度保持在50℃下10分钟，编程到80℃下5℃/min，然后在80℃下保持10分钟。 进样器和检测器温度分别为 200 和 230 ℃。 进样 (1 mL) 以分流模式 (150 mL/min) 完成。 氦气是载气 (2 mL/min, 90 kPa)。 挥发性化合物（乙醛、甲醇、乙酸乙酯、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇）通过比较保留时间与参考化合物。 为了量化，挥发物的标准溶液以通常在葡萄酒中发现的浓度范围内的浓度使用（Bertrand，1968 年；Gkoulioti，2000 年）。 所有分析均一式两份进行。 通过分析通常在葡萄酒中发现的两种不同浓度的五种加标模型葡萄酒溶液来评估该方法的重复性。 获得的相对标准偏差 (RSD %) 在 3.5% 和 8.2% 之间变化。

2.4.3. 统计分析

相关分析被用于检验葡萄酒的表面张力和化学成分之间的线性关系。 为了获得预测方程，使用了单一和多元回归分析。 使用SPSS软件，版本14.0进行计算。

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