1、实验部分

1.1仪器和试剂

SpectraMax M5型多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；MB100-4A型微孔板恒温震荡器（杭州奥盛仪器有限公司）；ZHLY-180型立式恒温振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司）；Sigma 3K15型台式高速冷冻离心机（德国希格玛公司）；ProFlex型PCR仪（美国赛默飞公司）；DV-ⅢULTRA型粘度计（美国Brookfield公司）；旋转滴法界面张力仪（芬兰Kibron公司）；EZ-Pi Plus便携式动态表面张力仪（芬兰Kibron公司）。

瓜尔胶为工业级，由长庆钰宸公司提供；葡萄糖、NaCl、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、NH4NO3、CuSO4、Na2MoO4·2H2O、FeSO4·7H2O、KCl、CaCl2、MnCl2·4H2O、D-‍甘露糖和3，‍5-‍二硝基水杨酸（3，‍5-Dinitrosalicylic acid，DNS）均为分析纯试剂；胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、蛋白胨、植物凝胶和琼脂均为生物试剂；细菌基因组DNA抽提试剂盒购买于德国凯杰QIAGEN公司；细菌16S rRNA基因通用引物8F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和805R（5'-GACTACCAGGGTATCTAATC-3'）由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

1.2实验方法

1.2.1样品来源与培养基

本实验所用的水样是由长庆油田提供的压裂液返排水，土样采自云南省楚雄市魔芋生产田地。

富集培养基：胰蛋白胨15.0 g/L、大豆蛋白胨5.0 g/L、酵母粉2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L、NaCl 5.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L；固体初筛培养基：瓜尔胶10.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、Na2HPO4 4.0 g/L、MgSO4 0.2 g/L、植物凝胶15.0 g/L、NH4NO3 1.0 g/L；复筛培养基：瓜尔胶10.0 g/L、NH4NO3 1.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、Na2HPO4 4.0 g/L、MgSO4 0.2 g/L、酵母粉0.5 g/L、微量元素1.0%（体积分数）；发酵产酶培养基：瓜尔胶15.0 g/L、NH4NO3 1.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、Na2HPO4 4.0 g/L、MgSO4 0.2 g/L、酵母粉0.5 g/L、微量元素1.0%（体积分数）；微量元素配方：CuSO4 0.1 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.1 g/L、FeSO4·7H2O 2.0 g/L、CaCl2 1.0 g/L、MnCl2·4H2O 0.5 g/L；种子培养基：蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L；LB固体培养基：蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L、琼脂18.0 g/L。以上培养基在使用前，均在121℃高压灭菌20 min。

1.2.2菌株的高通量筛选

称取1.0 g魔芋地土样于锥形瓶中（魔芋地的土壤环境适合β-甘露聚糖酶产生菌的生长），加入5.0 mL水样和100.0 mL蒸馏水，在37℃、180 r/min的立式恒温振荡培养箱（摇床）中震荡培养30 min，充分混匀后室温静置1 h，分层后取2.0 mL上层清液转接于200.0 mL富集培养基中培养，37℃、180 r/min恒温震荡48 h。取200.0μL富集培养的菌液均匀涂布于以瓜尔胶为唯一碳源的OD 90 mm（培养基直径为90 mm）固体初筛培养基上，倒置培养60 h，之后用1.0%（质量分数）刚果红染液染色，观察菌落周围有无透明圈，挑取透明圈大的单菌落转接到于装有2.0 mL复筛培养基的96孔培养板中继续培养，在微孔板恒温震荡器中37℃、500 r/min震荡培养48 h。将培养后的发酵液置于台式高速冷冻离心机（离心机）中，4℃、3000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液，根据瓜尔胶降解情况及酶活力大小进行复筛，同时进行甘油保藏（甘油和LB溶液的体积比为1∶1）。

1.2.3菌株的形态观察及种属鉴定

形态特征观察将筛选得到的菌株接种于种子培养基中，37℃、180 r/min活化培养，取对数生长期菌液稀释涂布于LB固体培养基上，37℃倒置培养，观察菌落的形态特征。采用革兰氏染色法，在显微镜下观察菌体结构，并通过扫描电子显微镜观察菌体形态及大小。

分子生物学鉴定按照细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书进行DNA的提取，以基因组DNA为模版，采用细菌的通用引物8F和805R进行PCR（聚合酶链式反应）扩增。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，送至上海华大基因科技有限公司测序。将测序结果在NCBI数据库中（http：//www.ncbi.nlm.gov/blast/）进行BLAST同源性比对（BLAST是在NCBI数据库中进行相似性分析的工具），并利用MEGA软件的N-J法构建系统发育进化树。

1.2.4酶活力的测定

采用3，5-二硝基水杨酸法对β-甘露聚糖酶酶活力进行测定，用pH=7.0的PBS缓冲液（每100 mL PBS缓冲液由38 mL 0.2 mol/L的Na2HPO4和62 mL 0.2 mol/L的KH2PO4配成）配制0.5%（质量分数）的瓜尔胶底物溶液。反应体系包含50.0μL粗酶液和450.0μL的瓜尔胶底物溶液，50℃反应10 min后，加入1.0 mL的DNS试剂终止反应，沸水浴10 min显色后，立刻冰水浴冷却至室温。取200.0µL反应液转移至96孔板中，在540 nm处用多功能酶标仪测定吸光度，实验每组设置3个平行，结果取平均值。以不同浓度D-甘露糖为标准品制作标准曲线，并根据标准曲线计算产生的还原糖量。在一定温度和pH值条件下，1 min催化底物水解产生1.0μmol相当于D-甘露糖的还原糖所需要的酶量，定义为1.0个酶活力单位。采用Bradford法测定蛋白质浓度，比活的定义为：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。

1.2.5酶学性质表征

粗酶液的制备在无菌环境下将筛选得到的菌株接种到种子培养基中，37℃、180 r/min活化培养24 h，按5.0%的接种量转接到发酵产酶培养基中，37℃、180 r/min摇床培养72 h，将发酵液于4℃下，9000 r/min离心20 min，收集上清液，上清液即为粗酶液，于4℃冰箱冷藏备用。

最适温度按照1.2.4小节的方法分别在不同温度：5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90和100℃下反应，测定β-甘露聚糖酶活力。以未经处理的同温度下的瓜尔胶底物溶液作为空白对照。以最适温度下的酶活力为100%，计算不同温度下的相对酶活力。实验每组设置3个平行样，结果取平均值（下同）。

最适pH值分别用pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的缓冲液配制0.5%（质量分数）瓜尔胶底物溶液，按照1.2.4小节的方法在最适温度下测定β-甘露聚糖酶活力。以未经处理的相同pH值的瓜尔胶底物溶液作为空白对照。以最适pH值下的酶活力为100%，计算不同pH值下的相对酶活力。

热稳定性将粗酶液分别在60、70和80℃的恒温水浴中孵育1 h，孵育期间每隔10 min取50.0µL该粗酶液加入瓜尔胶底物溶液中，按照1.2.4小节的方法在最适反应条件下测定β-甘露聚糖酶的残余活力，以评价酶的热稳定性。

pH值稳定性将粗酶液分别在pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的缓冲液中孵育2 h，孵育期间每隔20 min取50.0µL该粗酶液加入瓜尔胶底物溶液混匀。按照1.2.4小节的方法在最适条件下测定β-甘露聚糖酶的残余活力，以评价酶的pH值稳定性。

1.2.6低温降解瓜尔胶

配制0.8%（质量分数）的瓜尔胶底物溶液，加入1.0%（体积分数）的粗酶液，分别在5和20℃下恒温水浴，测定不同作用时间下瓜尔胶溶液的粘度变化，每次测量3次取平均值。以未经处理的瓜尔胶溶液作为空白对照，评价反应温度为5和20℃时，β-甘露聚糖酶对瓜尔胶的降粘效果。降粘率（Viscosity Reduction Rate，VRR）的计算如公式（1）所示：

式中，μ0为降粘前的粘度（mPa∙s），μ1为降粘后粘度（mPa∙s）。

1.2.7破胶性能评价

压裂液的配制按照国标SY/T 5107-2016《水基压裂液性能评价方法》中压裂液试样制备方法制备压裂液。压裂液配方为：基液：0.35%（质量分数）瓜尔胶、1.0%（质量分数）KCl、0.1%（质量分数）杀菌剂、0.18%（质量分数）Na2CO3、0.036%（质量分数）NaHCO3；交联液：1.0%（体积分数）硼砂溶液，交联剂比为100∶5（体积比）；酶破胶剂：1.0%（体积分数）。

粘度的测定按配方配制压裂液，将加入酶破胶剂的冻胶分别置于5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80和90℃的恒温水浴中，在破胶3和6 h时取其上层清液，于室温下用粘度计测定破胶液的粘度，每次测量3次取平均值（下同）。

表面张力和界面张力的测定待压裂液交联后，加入酶破胶剂，分别在10、20和50℃的恒温水浴中破胶3 h，待破胶液的粘度降低到5 mPa·s以下后，将破胶液倒入烧杯中，用表面张力仪测定破胶液的表面张力，用界面张力仪测定破胶液与煤油界面张力，测试温度为50℃。

残渣量的测定按照国标SY/T 5107-2016《水基压裂液性能评价方法》中指出的残渣量的检测方法进行测定。制备定量体积V0的压裂液冻胶，加入酶破胶剂，分别置于10、20和50℃的恒温水浴中破胶。室温测定破胶液粘度低于5 mPa·s时视为彻底破胶。将彻底破胶后的溶液全部转移到已经烘干称重的离心管中（质量记为m0），在离心机中5000 r/min离心30 min，慢慢倒出上层清液，然后用蒸馏水清洗破胶容器后倒入离心管中，再次离心20 min并倒出上层清液。将离心管放入干燥箱中105℃下烘干至恒重（质量记为m1）。压裂液残渣含量计算如公式（2）所示：

式中，η为压裂液残渣质量浓度（mg/L）；（m1-m0）为残渣质量（mg）；V0为压裂液用量（mL）。

产低温β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低温油藏压裂液的破胶性能——摘要

产低温β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低温油藏压裂液的破胶性能——实验部分

产低温β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低温油藏压裂液的破胶性能——结果与讨论、结论