β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分，约占乳清蛋白总量的50%。β-乳球蛋白分子质量约为18.4 kDa，等电点为5.1～5.3，含有162个氨基酸残基，具有良好的凝胶，起泡和乳化性能。在一定条件下，蛋白质单体经过构象改变，β-折叠增多并重新排列而发生聚集，这种聚集可以产生蛋白质纳米纤维。蛋白质纳米纤维是蛋白质在低pH值（例如pH 2.0～3.0）条件下进行热处理得到的长直型自组装产物，其直径和长度尺寸分别在2～5 nm和200 nm～15μm范围内，是具有较大长径比的形状各向异性材料。Dietler等通过原子力显微镜表征了蛋白质纳米纤维的精细结构，认为蛋白质纳米纤维最初形成“原纤维”即单股聚集体，然后经过螺旋缠绕逐步形成多股螺旋结构，形成成熟的纳米纤维。蛋白质纳米纤维具有许多特殊的物理化学特性以及生物特性，例如具有良好的表面活性和细胞穿透性，可被用于药物载体的构建以强化细胞吸收。同时因其良好的流变特性，可用作增稠剂和凝胶填充物。蛋白质纤维聚集体具有特殊的表面活性。Mezzenga等比较了天然β-乳球蛋白及其纳米纤维在油水和汽水界面的吸附和剪切流变性质，发现热处理蛋白形成的纤维聚集体可以吸附于油水界面，其界面剪切模量明显高于天然蛋白质。该研究还发现，未转化成纤维聚集体的多肽的存在有可能会提高蛋白界面吸附和乳化性质。该团队还发现，改变水相的pH值和离子强度，蛋白质纤维聚集体在油水界面具有不同的排列模式，并产生不同的界面流变特性。Gao Zhiming等也曾对蛋白质纳米纤维的乳化活性做过报道。

蛋白质纤维化转变过程较长（约4～10 h），其形成过程较为复杂。在纤维生成的不同阶段，其产物的组成、结构、尺寸以及界面性质及乳化活性均不同。本实验主要针对β-乳球蛋白在纤维形成的不同阶段，研究其产物的界面及乳化活性，为其在食品工业中的合理利用提供理论依据，特别是富含蛋白质的饮料。

1材料与方法

1.1材料与试剂

食用大豆油市售；β-乳球蛋白（蛋白质干基质量分数97%，其中β-乳球蛋白占95.9%）美国Davisco食品公司；硫磺素T（thioflavin-T，ThT）、硅镁型吸附剂/氟罗里硅土（Florisil分子筛，60～100目）美国Sigma-Aldrich公司。

1.2仪器与设备

SuperG超微量天平，芬兰Kibron公司；Direct Q3型超纯水机美国Merck Millipore公司；FE-20 FiveEasy Plus pH计梅特勒-托利多国际股份有限公司；F-7000荧光分光光度计日本日立公司；Multifuge高速冷冻离心机赛默飞世尔科技（中国）有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；JEM-2100（HR）透射电子显微镜日本电子Jeol公司；TRACKER界面流变仪，法国Teclis界面技术有限公司；PT-MR 2100型高速剪切乳化机瑞士Kinematica公司；Mastersizer 2000型激光粒度仪英国Malvern公司。

1.3方法

1.3.1蛋白质纳米纤维的制备

将β-乳球蛋白分散于去离子水中（2%），室温搅拌2 h，使其充分水化。调节蛋白质分散液pH 2.0，置于80℃水浴锅加热20 h，此过程持续磁力搅拌，每隔2 h定时取样，取出后立即浸没在冰水混合物中，冷却20 min，随后保存于冰箱备用。

1.3.2蛋白质纳米纤维形成动力学表征

将12.0 mg ThT溶解于10 mL去离子水中，充分溶解后，用0.22μm水相滤膜过滤，于4℃冰箱中避光保存。在制备β-乳球蛋白纳米纤维的过程中，取不同加热时间样品2.98 mL，加入20µL ThT储藏液，均匀混合，反应1 min后进行测量。激发和发射波长分别为450 nm和482 nm，激发和发射狭缝均为5 nm，电压为400 mV。

1.3.3透射电子显微镜

将β-乳球蛋白纤维分散液用pH 2.0的去离子水稀释到质量分数为0.05%，在水浴超声清洗装置中以功率50%超声处理10 min，促进样品分散。接着，用移液枪吸取10μL样品滴至铜网上，自然晾干，随后用毛细管吸取2 g/100 mL的磷钨酸（水浴超声30 min，100%功率，且用0.22μm水相滤膜过滤）滴至样品表层，再次晾干后进行电镜观察。

1.3.4界面吸附和界面流变行为分析

分别通过分析蛋白质纤维聚集体在界面吸附过程中的界面张力变化和膨胀黏弹模量的变化分析其界面吸附行为和界面流变行为。取不同阶段所形成的混合分散体系稀释至质量分数0.01%并调pH 3.5后进行界面分析，选取界面流变仪的悬滴模式检测样品在油-水界面上的吸附情况。量取5 mL混合分散液于样品槽中，将U形样品针浸入水相中，并通过马达控制形成10μL的油滴。该实验在室温条件下进行，测定时间持续12 000 s，测试频率0.05 Hz，振幅10%。在检测过程中，整个检测系统应保持平衡，避免外界振动干扰测量。

由于食用大豆油中含有的少量小分子表面活性成分容易对测定结果产生干扰，因此使用前需要进行纯化。参考Gaonkar等[20]的方法，在100 mL食用大豆油中加入3 g Florisil分子筛吸附剂，随后搅拌0.5 h，静置5 min，5 000 r/min离心20 min，再加入新的吸附剂，重复上述操作3次，收集纯化后的大豆油，利用界面流变仪测定去离子水的界面张力，直到其界面张力在30 min内下降不超过0.5 mN/m即可满足要求。纯化后大豆油的密度为0.914 2 g/cm3，去离子水与油相的界面张力为（27±0.1）mN/m。

1.3.5乳液制备及表征

乳液的制备：将一定量的β-乳球蛋白纤维化产物用去离子水稀释至一定浓度，并用1 mol/L NaOH溶液调pH值至3.5，加入大豆油，配成蛋白总质量分数为0.5%，油量体积分数为10%的混合液，采用高速剪切进行乳化20 000 r/min离心2 min，乳液中添加0.4 g/L的叠氮钠防菌。

粒径分析：以去离子水为分散介质，采用Mastersizer 2000激光粒度仪测定乳液粒径分布及平均粒径。测定加样前先将乳液轻微振荡摇匀，再逐滴加至分散介质中，直到信号满足测试要求。分散相和连续相的折光指数分别采用1.475和1.33，遮光度为10%～20%，样品的吸收率为0.1%，泵转速为2 000 r/min。每个样品平行测量3次，取平均值。