结果和讨论

表面压缩性和酶活性。 纯DMPA和混合DSAP/DMPA单层的表面压力分子面积等温线如图1所示，与先前的结果一致。20,40对于纯DMPA单层，每个分子在55和44Å2之间存在一个典型的平台，对应于液体膨胀（LE）和液体冷凝（LC）相的共存区， 而LE-LC转变发生在8.0mn/m。 与此相反，DSAP/DMPA混合单分子膜不存在共存区，液相膨胀相保持，直到表面压力达到20 mN/m以下。

图1.朗缪尔单分子膜的表面压力-面积曲线：纯DMPA（O）和DSAP/DMPA（1:3500，mol:mol）（4）。 曲线中显示的断点与混合单层的LE-LC转变有关。

值得注意的是，为了避免不可逆的酶聚集，蛋白质被分散在预成型的DMPA单分子膜上，而不是注入亚相。 此外，溶解酶储备溶液中的C12（EO）9 0.01%在扩散后进一步稀释，这无疑有利于酶在界面上的位置，我们可以将此过程确定为“无表面活性剂酶的表面渗透”。 这一过程是实验条件的结果，因为在亚相中将表面活性剂稀释至10-6%（或0.21µmol/L）会使系统进一步低于碱性磷酸酶/C12（EO）9（3.6µmol/L20,22）混合系统的临界聚集浓度（CAC）42。 事实上，表面活性剂的稀释已被用作诱导GPI锚定蛋白质分子层吸附的成功方法。22,27此外，先前的数据20,22表明，向体积浓度为0.21µM的纯水中添加C12（EO）9不会引起表面张力的变化， 既不适用于清洁空气/水界面，也不适用于DMPA单层。

与酶表面沉淀过程相关的疏水性锚定物的存在强烈表明，酶的总扩散量应保持在与磷脂形成混合单层的空气/液体界面，而底物（PNPP）及其水解产物（对硝基苯酚和无机磷酸盐） 应保持在子阶段。 这与一些关于脂肪酶催化活性的报告43-48大不相同。 在这些研究中，酶被注射到亚相，在吸附到界面后，它会对该界面上的脂质进行化学修饰。 相比之下，在目前的研究中，脂质单层充当酶的基质，并且在化学上不受影响。 此外，在对照实验中未观察到PNPP水解：在侧隔室中未检测到吸光度或活性，这意味着酶在亚相中未溶解。 另一方面，在存在混合单层的中央腔室中检测到催化活性。 这一结果明确地表明，在所采用的实验条件下，酶没有分散在亚相中，而是完全吸附在气液界面上。 还估计了在无酶的情况下PNPP的自发水解，考虑到实验所用的时间间隔，可以忽略。

在5到18 mN/m的表面压力下，DMPA的表面密度从1.45×1017分子/m2变化到2.30×1017分子/m2。 考虑到DMPA和DSAP都保留在界面上，单层的压缩应减少磷脂和蛋白质的可用面积。 因此，可以估计酶的表面密度，并将其与酶活性关联起来（图2）。 高达12.1 ng/cm2（对应于18 mN/m的表面压力）时，观察到线性相关性，表明活性的增加直接反映了酶表面密度的增加。 然而，当蛋白质表面密度高于12.1 ng/cm2时，酶活性会突然下降。

图3显示了表面压力对表面压缩模量Cs-1的影响（定义49为表面压缩性的倒数：Cs-1）[-A(∂π/∂A） ]T），以及DMPA朗缪尔单层中DSAP的酶活性。表面压缩模量在图3中是首选的，因为它随着表面堆积而增加，并且也可以与单层的状态相关。液体冷凝膜的Cs-1值通常高于50 mN/m。事实上，曲线中的断点（在图1中19（1 mN/m）处观察到）伴随着压缩模量的突然增加（对于可忽略的面积/表面压力变化，从55 mN/m到62 mN/m）此外，随着表面压力的增加，单层膜上的酶活性增加至均匀介质中酶活性的91%，直到18 mN/m。尽管酶活性始终低于溶液中测得的酶活性，但与表面压力无关，最大值与先前的报告21-23,50形成对比固定在固体载体上的碱性磷酸酶的酶活性，其在均相介质中的活性范围为10%至45%。事实上，这些研究中从未使用过低于20 mN/m的表面压力，因为单层的高压缩性阻碍了其向固体载体的转移。

此外，一些研究51揭示了Na+/K+-ATP酶活性与周围膜脂的堆积之间的强烈相关性，尽管膜组成也表现出显著的影响。

在空气/液体界面观察到的DSAP的最大活性发生在18 mN/m的表面压力下（图3）。如表面压缩模量Cs-1的增加所示，酶活性在该值以上突然下降，单层压缩性也随之下降。这一结果可以解释图2中观察到的表面密度高于12.1 ng/cm2时酶活性急剧下降的原因。通过对比分析压缩模量与表面密度相比，压缩模量的显著增加（与单层的表面堆积有关）成为影响酶活性的主要因素，超过18 mN/m。值得注意的是，与在35-165 mN/m范围内观察到的Cs-1的显著变化无关（π在19和30 mN/m之间），酶活性几乎保持不变，在均匀培养基中约为活性的50%。这一结果与报道的在30 mN/m表面压力下转移的DMPA/DSAP混合单层23 LB膜的43%活性密切相关，尽管蛋白质表面密度显著较高（179 ng/cm2）。事实上，在相同表面压力下，表面密度的增加导致酶活性显著降低，这表明GPI锚定酶的活性不仅取决于蛋白质表面密度，还取决于混合单层或分子表面堆积的可压缩性。

图2.估计酶表面密度的影响（Γ）关于PNPPA酶活性。酶活性表示为在均匀介质中测得的酶活性的百分比。最大值对应于12.1 ng/cm2的酶表面密度。0-12 ng/cm2的范围对应于0-18 mN/m的表面压力；但是，观察到，在图中所示的最高表面密度中，曲线不是t线性。图3更好地分析了对表面压力的依赖性。

图3.（9）在几种表面压力下，DSAP/DMPA（1:3500，mol:mol）混合单分子膜中DSAP的PNPPA酶活性。（b）DSAP/DMPA混合单分子膜的压缩模量。酶活性表示为均相介质中估计值的百分比。

综上所述，酶活性降低超过18 mN/m（每平方厘米12纳克DSAP）与混合单分子层的液体凝聚相的实现相一致。因此，酶通过其锚插入的基质包装条件的变化可能会对蛋白质的柔韧性产生深远的影响，这是其功能活性的必要条件，尽管多肽部分之间的距离tive站点位于，并且接口。

然而，表面压力和催化活性数据不能提供表面堆积如何影响酶/脂质混合单层形态的信息。

荧光显微镜。荧光显微镜是一种通过荧光探针在薄膜中的分布来显示气液界面形貌的有趣方法。当使用脂质探针时，对比度取决于它们在血液层的浓缩和膨胀相中的相对溶解度，而使用荧光标记的酶可以识别富含蛋白质的区域。图4显示了使用约1 mol%用荧光素标记的DSAP获得的DMPA/DSAP混合单层的荧光显微照片。在0 mN/m表面压力下，在明亮的连续场上观察到黑斑。在这种表面压力下，纯DMPA单分子膜中不存在这些结构域，这些结构域应该对应于在混合单分子膜上发生的某种分离，这种分离是由蛋白质的存在引起的。随着表面压力的增加，可以观察到一些这样的区域聚集成分形图案。从FM显微照片中获得的最重要的发现是DMPA/DSAP单分子膜中存在不均匀畴，随着表面压力的增加，这些畴变得更亮。在较高的表面压力下，可能会看到具有三种不同光强度模式的区域。较亮的区域对应于富含蛋白质的区域，而较暗的区域应对应于蛋白质贫乏的区域，因为在考虑标记比率时，荧光素标签之间的荧光猝灭是极不可能的。在高于18 mN/m的表面压力下观察到的强亮度对应于混合单层压缩模量突然增加的范围（见图3）。

图4.DSAP/DMPA单分子膜（1:3500，mol:mol）在几种表面压力下的荧光显微照片。

高达18 mN/m时，分形图案与单个暗畴共存。在20 mN/m时，暗域不再是离散的，但发生了渗流机制，导致明亮的富含蛋白质的域最终分离。这幅图可以归因于富含蛋白质的相被贫蛋白质相包围，呈分形渗流结构分布。这与其他显示GPI锚定蛋白在液相有序相中被划分的报告一致。27

据报道，GPI锚定的蛋白质在脂质界面形成（或诱导形成）聚集体。6,8,27,30-34,52在生物膜模型如双层膜、脂质体、单层膜和Langmuir-Blodgett膜中也观察到了这些簇。27,24,34，这些簇群是否是GPA介导蛋白质结构或脂质组成的结果尚待阐明。17,32 FM研究的结果（图4）表明DMPA/DSAP混合单分子膜中存在相分离以及脂质和蛋白质聚集体。

提出了将表面密度和表面堆积与催化活性关联的模型。提出了一个通过脂质表面堆积和气液界面酶表面密度调节DSAP方向和催化活性的模型（图5）。碱性磷酸酶的催化位点可能位于GPI锚的另一侧。1,53在本研究所用的系统中，疏水锚应位于与DMPA酰基相互作用的空气/水界面，而催化位点必须朝向亚相，其中基材PNPP溶解。在低表面压力下（图5A），催化活性主要取决于蛋白质表面密度。考虑到表面压缩定义了平均酶表面密度（图2），当表面压力上升到18 mN/m时，界面中的疏水锚定排列可能有利于多肽部分向亚相调整（图5B）。这将允许PNPP在扩散控制过程中进入酶的催化部位，从而提高酶的活性，达到均相培养基中获得的活性的91%（图3）。尽管增加了酶的估计平均表面密度（图2），但混合单层的进一步压缩会导致催化活性的突然降低，与单层压缩性的显著降低（图3）和蛋白质簇的形成（图4）相关，这可能会影响底物对催化部位的可达性（图5C）。该模型解释了在30 mN/m条件下转移的DSAP/DMPA混合LB膜23之前获得的催化活性极限值约为43%。

图5. 在（A）以下、（C）以上和（B）值的表面压力下，酶/磷脂混合单层的DSAP取向示意图模型，观察到单层表面压缩模量的突然增加。 横向箭头表示表面压力（π）、估计的酶表面密度（Γ）和压缩模量（Cs-1）的增加方向。

分子表面包装对于磷脂单分子层膜中的锚定蛋白中酶活性的调制作用的影响——摘要、介绍

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