2.实验材料和方法

第二节一般试剂。对于所有步骤，均使用去离子水（去离子水，Mar Cor优质混床去离子，25°C时电阻率为18.2 MΩ3 cm）。通过在去离子水中溶解适量的NaH2PO4和NaN3，然后用1 M HCl调节pH至7.2，制备用于荧光显微镜的磷酸盐缓冲盐（PBS）溶液；在整个研究过程中，最终浓度为10 mM磷酸盐和30 mM NaN3。PBS的离子强度通过添加NaCl来调节。Pluronic F-127（Invitrogen，MW∼12 500）用PBS稀释至0.010 mg/mL作为储备溶液。二硫苏糖醇（DTT）购自Fisher Scientific。

通过荧光显微镜对AWI处的蛋白质组装进行成像。如图1A所示，HSA-TR在一个特殊设计的密封室中成像，其中蛋白质水相（体积10μL，厚度100-200μm）与一层厚度也为100-200μm的空气共存。该室由聚二甲基硅氧烷组装而成，并用聚乙二醇（MW 5000）对覆盖玻璃进行改性，以减少蛋白质在固液界面上的竞争吸附。（参见支持信息中的样品室和表面改性以及图S1。）在该室中形成的AWI与显微镜台形成的XY平面平行。与之前对圆形液滴成像的尝试相比，这有助于界面成像。通过在界面处聚焦（称为XY平面图像）或以0.1μm/步的步长垂直于界面扫描（称为XZ平面图像），收集了23,30张图像。使用Olympus IX81倒置显微镜获取共焦图像。表观荧光图像由耦合到奥林巴斯IX81系统的高光谱CCD（CRi Nuance FX）相机捕获。物镜（40，浸水，1.15 NA）通过使用543 nm激光或带有530-550 nm带通激发滤光片的汞灯激发染料，从下方对样品溶液成像。在575-655nm范围内收集发射。光漂白后荧光恢复（FRAP）实验在同一共焦显微镜上进行，带有奥林巴斯SIM扫描仪装置。使用100%功率的351 nm激光在AWI处对蛋白质层的小区域进行20 s的光漂白。使用543 nm激光（停留时间为2μs/像素）在光漂白之前、期间和之后捕获区域的共焦图像。使用ImageJ软件对图像进行分析。31

图1。（A）样品室和倒置显微镜设置。（B-G）在AWI条件下，pH 7.2，离子强度=193 mM的PBS中HSA-TR的共焦图像。（B，C）HSA-TR（0.050 mg/mL）或（D，E）HSA-TR（0.025 mg/mL）的XY平面图像。图像C和E使用4倍光学变焦。穿过（F）HSA-TR（0.050 mg/mL）或（G）HSA-TR（0.025 mg/mL）AWI的XZ平面图像。比例尺：20μm。

蛋白质标记。商用HSA（Sigma-Aldrich）用胺反应性荧光团Texas Red-X琥珀酰亚胺酯（Invitrogen）标记。首先将Texas Red-X溶解在二甲基甲酰胺（10 mg/mL）中，然后缓慢添加少量该浓缩染料溶液，同时搅拌至蛋白质水溶液（0.1 M NaHCO3缓冲液中的2 mg/mL HSA，pH 8.3）。混合后染料与蛋白质的摩尔比为10:1。用铝箔覆盖反应溶液，并在室温下连续搅拌1h。然后通过10-DG柱（Bio-Rad）运行反应溶液，去除未反应的染料。用PBS洗脱标记的蛋白质，并在4°C下，在9 krpm下，用3 kDa截止分子量离心过滤装置（微孔）进一步浓缩和纯化30 min，并用10 kDa透析盒（Thermo Scientific）对1 L 10 mM磷酸盐缓冲液透析1周。以牛血清白蛋白（BSA，Thermo Scientific）为标准，通过Lowry分析（Thermo Scientific）测定标记蛋白的最终浓度。紫外-可见光谱和MALDI-TOF质谱显示标记的染料与蛋白质的比率分别为1.3和1.5。（参见支持信息中的染料与蛋白质比率测量和图S2。）将产品溶液分成等份，并在-20°C下储存以供进一步使用。

染料标记和未标记蛋白质的比较。通过圆二色谱（CD）光谱和表面压力测量对HSA和HSA-TR进行比较。将AWI处标记或未标记蛋白质形成的蛋白质层转移到云母表面，并使用敲击模式AFM（数字仪器）测量高度，并使用Nanoscope IIIa软件（5.12版，数字仪器）进行处理。

CD测量在带有珀耳帖温度控制器的Chirascan CD光谱仪上进行。在10mM磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中，用10mM NaCl将HSA和HSA-TR稀释至0.10mg/mL，然后转移至0.1cm路径长度的试管中。HSA和HSA-TR的远紫外CD光谱在25°C下收集，波长范围为190-260 nm，扫描速率为0.5 nm/s，狭缝带宽为1.0 nm。在25℃和95℃之间记录热变性曲线，每一步增加2℃和120 s平衡时间。使用带有线探针微量天平的MicroTroughX-Langmuir槽测量表面压力（Kibron，Inc.）。将10mM PBS中的HSA或HSA-TR（0.10mg/mL）用移液管移到微槽中。在AWI立即形成后1小时内记录表面压力。然后，使用Langmuir-Schaefer技术，通过Kibron微槽控制器，将AWI处的层转移到新劈开的云母表面上。32使用去离子水进行冲洗步骤，以冲洗掉样品表面上多余的盐。样品在空气中干燥，然后在空气中使用超锐悬臂梁（NSC16，MikroMasch）在攻丝模式下通过AFM进行研究。使用WSxM软件（Nanotec）分析AFM图像以确定膜厚度。33

应用荧光显微镜研究了蛋白质在气-水界面的组装——摘要、介绍

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