１．１结晶方法（ＣｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）

１．１．１分批结晶（ＢａｔｃｈＣｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。幸运的话，不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体。一个用于微分批结晶的自动化系统已被Ｃｈａｙｅｎ等人设计出（１９９１，１９９２），其微分批方法中，他们在１－２μｌ包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发，它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂（Ｃｈａｙｅｎ，１９９７；ｓｅｅａｌｓｏＣｈａｙｅｎ，１９９８）。

１．１．２液－液扩散（Ｌｉｑｕｉｄ–ＬｉｑｕｉｄＤｉｆｆｕｓｉｏｎ）这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可（如图１．２）。下层是密度大的溶液，例如浓硫酸铵或ＰＥＧ溶液。如果有机溶剂如ＭＰＤ被用作沉淀剂，它会在上层。以１：１混合，沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍。两种溶液（各自约５μｌ）通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。Ｇａｒｃ´？ａ－ＲｕｉｚａｎｄＭｏｒｅｎｏ（１９９４）已经发展液－液扩散技术至针刺法。蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中，凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上，整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。这也可作为一个筛选最佳结晶条件的额外信息。

１．１．３蒸气扩散（ＶａｐｏｒＤｉｆｆｕｓｉｏｎ）

１．１．３．１悬滴法（ＴｈｅＨａｎｇｉｎｇＤｒｏｐＭｅｔｈｏｄ）这种方法中，在一个硅化的显微镜盖玻片上通过混合３－１０μｌ蛋白质溶液和等量的沉淀剂溶液来制备液滴。盖玻片置于一个盘子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀剂溶液约１ｍｌ。在盖玻片放好之前，小室的凹槽周围用油或油脂密封（如图３）。

１．１．３．２沉滴法（ＴｈｅＳｉｔｔｉｎｇＤｒｏｐＭｅｔｈｏｄ）在悬滴法中，如果蛋白质溶

液表面张力很小就会在盖玻片表面展开。此时，沉滴法更有利，图４给出了沉滴法的简图。

１．１．４透析法（Ｄｉａｌｙｓｉｓ）除了上述使得蛋白质结晶的方法，还有许多透析技术。透析的优点是沉淀溶液容易改变，对于适量的蛋白质溶液（多于０．１ｍｌ），可用透析管完成（如图１．５ａ）。透析膜通过橡皮圈连在管子上，但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮约１０ｍｉｎ。对微升量的蛋白质溶液而言，可以使用覆有透析膜的厚壁微毛细管（Ｚｅｐｐｅｚａｕｅｒｍｅｔｈｏｄ）或者树脂玻璃纽扣（如图１．５ｂ）。纽扣的缺点是纽扣中的蛋白质晶体不能通过极化显微镜观察到。

另一中微透析方法在图１．６中有描述，将５μｌ蛋白质溶液注射到一个毛细管中，毛细管覆有透析膜，膜可用塑料管套紧。对蛋白质溶液进行简单离心，然后用铸模粘土将毛细管封闭，接着将毛细管放入含有透析液的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。

机遇造就第一个膜蛋白晶体结构的解析

１９８８年诺贝尔化学奖被授予三位德国科学家，他们分别是哈特穆特·米歇尔（ＨａｒｔｍｕｔＭｉｃｈｅｌ）、约翰·戴森霍弗（ＪｏｈａｎｎＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ）和罗伯特·休伯（ＲｏｂｅｒｔＨｕｂｅｒ），以表彰他们对膜蛋白结构生物学的巨大贡献。这三个人通力合作，在世界上首次解析了一种膜蛋白——紫细菌光合反应中心的高分辨率三维结构。紫细菌光合反应中心三维结构的解析，拉开了膜蛋白结构生物学的序幕，在生物学界影响非常大。然而，在这样一个获诺贝尔化学奖的重大研究成果背后，却隐藏着一段不为人知的故事，其中就包涵了“抓住机遇发现科学事实”的科学方法论。

蛋白质是构成生物体的最基本物质之一，它在生物体的各种生命活动中扮演着极其重要的角色，如催化体内几乎全部反应的酶。在所有蛋白质中，膜蛋白的作用更为重要。膜蛋白位于细胞的膜系统上，充当很多角色，比如细胞膜上用来接受胞外信号的受体，以及用来转运离子和分子的离子通道和转运体。为了解释蛋白质的具体作用机制，就必须在原子分辨率水平观察到蛋白质的三维结构，以及蛋白质和与其相互作用的分子形成的复合物的结构。这要用到一种叫做Ｘ射线晶体学的方法。据统计，Ｘ射线晶体学已造就了十多个诺贝尔奖。使用这种方法的前提是得到所研究对象的高质量单晶，若要解析某个蛋白质的结构，就首先要生长出目标蛋白的单晶。这对于一般的胞内可溶性蛋白来说，似乎不是那么难。１９６２年，两位英国科学家约翰·考德里·肯德鲁（ＪｏｈｎＣｏｗｄｅｒｙＫｅｎｄｒｅｗ）和马科斯·斐迪南·佩鲁兹（ＭａｘＦｅｒｄｉｎａｎｄＰｅｒｕｔｚ）因对肌红蛋白结构的研究而被授予当年的诺贝尔化学奖。这里说到的肌红蛋白是一种胞内可溶性蛋白，而不是膜蛋白。可溶性蛋白的结晶虽然已经实现，但是这对膜蛋白来说还不能实现。由于膜蛋白具有很强的疏水性，在溶液中是难溶的，因此想要得到膜蛋白的晶体在当时被认为是不可能的，这一点已经写进了当时的权威教科书。

首次成功得到膜蛋白的晶体源于哈特穆特·米歇尔的一次偶然发现。米歇尔于１９４８年出生在德国符腾堡州的路德维希堡。大学毕业后，他在图宾根马普研究所的迪特尔·奥斯蒂希特（ＤｉｅｔｅｒＯｅｓｔｅｒｈｅｌｔ）实验室做关于盐杆菌的研究。当时，奥斯蒂希特与他人合作在盐杆菌中发现了菌紫红质，后来他提出菌紫红质可看作皮特·米切尔（ＰｅｔｅｒＭｉｔｃｈｅｌｌ，１９７８年诺贝尔化学奖获得者）的化学渗透理论框架中的光驱动的质子泵。米歇尔于１９７７年在维尔茨堡马普研究所取得博士学位后，作为课题的延续，他打算将脱脂的菌紫红质与细菌囊泡进行融合，以实现光驱动的氨基酸摄入。当样品在冰箱里贮存期间，米歇尔偶然发现脱脂的菌紫红质形成了固态的玻璃状聚集体。基于这个发现，他确信应该可以生长出像菌紫红质这样的膜蛋白的晶体，虽然这在当时被认为是不可能的。米歇尔关于结晶菌紫红质的想法得到了他的导师奥斯蒂希特的鼓励和支持，于是实验正式启动。四周后，米歇尔就得到了菌紫红质的二维晶体，但不是他所想要的用来做Ｘ射线衍射实验的三维晶体。功夫不负有心人，终于在１９７９年４月，米歇尔得到了第一个真正的菌紫红质三维晶体。于是，他取消了去美国攻读博士后的计划，把全部精力投在了继续生长菌紫红质晶体上。

虽然得到了菌紫红质的三维晶体，但是当米歇尔进行Ｘ射线衍射实验时，发现该晶体内部堆积混乱，而且晶体又小，不足以进行结构分析。此外，由于当时德国没有Ｘ射线衍射仪，他只能去英国剑桥去试晶体。在剑桥，很多晶体学家则要做关于可溶性蛋白晶体的Ｘ射线衍射实验，所以即使米歇尔去了英国，也几乎没有机会能用上Ｘ射线衍射仪。然而，他没有浪费时间，而是在这段时间对菌紫红质的晶体进行了优化。后来，米歇尔回到德国，他所在实验室的主任罗伯特·休伯决定购买一台Ｘ射线衍射仪以满足米歇尔的实验需要，可惜的是菌紫红质的晶体质量一直没能提高。

尽管遭受重大挫折，但是米歇尔根据他最初的观察和分析，坚信自己一定能长出高质量的膜蛋白单晶。于是，他尝试去结晶别的膜蛋白，其中最有希望的膜蛋白——紫细菌光合反应中心被成功结晶了，而且衍射质量非常好，这是在１９８１年９月。在Ｘ射线衍射仪上收集了大量数据后，米歇尔就开始了结构分析工作。后来，约翰·戴森霍弗也加入到了这个课题研究中来。最终，他们成功解析了紫细菌光合反应中心的三维结构，分辨率为３埃，文章发表于１９８５年Ｎａｔｕｒｅ杂志上。仅仅三年后，米歇尔、戴森霍弗和休伯就被授予１９８８年诺贝尔化学奖，这不能不说是一个奇迹，因为获得诺贝尔奖的成果大多是要经过十年以上的等待后才被授予诺贝尔奖的。

米歇尔获诺贝尔奖时只有４０岁，这在诺贝尔化学奖获得者中是相当年轻的。米歇尔不仅是解析第一个膜蛋白三维结构的最大贡献者，还是后来膜蛋白结晶技术发展过程中抗体片段介导的膜蛋白结晶法的发明者。由米歇尔等三位诺贝尔化学奖获得者开启的膜蛋白结构生物学现在已经非常热门。２００３年诺贝尔化学奖再一次被授予解析细胞膜上的钾离子通道和水通道的两位美国科学家——罗德里克·麦金农（ＲｏｄｅｒｉｃｋＭａｃｋｉｎｎｏｎ）和皮特·阿格雷（ＰｅｔｅｒＡｇｒｅ）。回顾米歇尔成功结晶第一个膜蛋白的历程，１９７７年的那次偶然发现是至关重要的。如果当时他没有仔细观察，或者观察到了却没当作一回事，那么他也就不会去尝试结晶膜蛋白了，更不会获得诺贝尔奖了。正是由于他抓住了那次机遇，进行了认真分析后，坚信自己一定能生长出当时被认为不可能的膜蛋白晶体。于是，他那样做了，他打破常规的创新想法受到了导师的大力支持，最终他成功了！

像这样的例子还有很多，比如日本科学家白川英树发现导电塑料，华裔科学家钱永健发明钙染料等。无数科学研究上的成功案例告诉我们：一定要抓住机遇发现科学事实！同时，必须记住：机遇只偏爱有准备的头脑。在科研过程中，我们应该随时准备着去发现，去思考，去探索！

诺贝尔化学奖之核糖体的精细复杂的晶体结构

真的没有想到今年的诺贝尔化学奖会颁给核糖体的结构研究，不过还是非常兴奋的，因为本人亦在从事通过Ｘ射线晶体学解析蛋白质结构领域的研究。曾经就觉得解析核糖体（由大、小两个亚基构成）的晶体结构的文章很不平凡，因为报道大亚基结构的文章在Ｓｃｉｅｎｃｅ上撰写了１６页（普通文章４页左右）；刚查到报道小亚基结构的文章亦在Ｎａｔｕｒｅ上撰写了１３页（普通文章６页左右）。

这两篇文章以及另一篇解析核糖体小亚基的文章都发表于２０００年，也就是说短短过了９年，三位负责人就获得了诺贝尔奖。当然这里说短短其实已经非常长了（原因下一篇再谈，呵呵）。

接下来，就来看看他们三位的绝世文章及里面的精美图片吧！

蛋白质结晶系列之一（自译）

１．蛋白质结晶（ＣｒｙｓｔａｌｌｉｚｉｎｇａＰｒｏｔｅｉｎ）

１．１引言（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）

当别人在谈论傅立叶和帕特森，或者分子置换及分子动力学改良时，新到蛋白质Ｘ射线晶体学实验室的同学们可能会迷惑。然而，他们立即会明白要想确定蛋白质的结构，首先必须生长出合适的晶体。没有晶体，便谈不上用Ｘ射线确定蛋白质结构。这一章，我们讨论蛋白质晶体生长的原理。作为实践，我们将给出结晶溶菌酶的方法。我们还将得到一个溶菌酶晶体的Ｘ射线衍射图像，

这将提供对Ｘ射线衍射的简介。这一章包括一个关于常见问题的讨论。

１．２蛋白质结晶原理（ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＣｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）

蛋白质的Ｘ射线结构分析首先要获得合适的单晶。蛋白质结晶学尚未发展成熟，尽管很受人亲睐，特别是受航天飞机中微重力实验（Ｋｕｎｄｒｏｔｅｔａｌ．，２００１；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，１９９５）的激发。蛋白质结晶是一个反复试验的过程，蛋白质逐渐会从溶液中析出，杂质、晶核及其他未知因素对此过程有所影响。通常，蛋白质越纯，生长晶体几率越大。蛋白质结晶学者对蛋白质的纯度要求要严于生化学家的要求，后者往往在酶催化活性足够高时就很满意。另一方面，为了使蛋白质结晶，不仅要加其他成分，所有蛋白质分子的表面性质也必须是相同的，特别是表面的电荷分布，因为它影响晶体内分子的聚集。质谱是蛋白质结晶中的一种有效工具，例如检测重组蛋白的表达、样品纯度、重原子衍生物及蛋白质结构的特性（Ｃｏｈｅｎ，１９９６；Ｐｏｔｉｅｒｅｔａｌ．，２０００）。

蛋白质结晶涉及四个重要步骤如下：

１．蛋白质纯度的确定。如果不够非常纯，必须要进一步纯化。

２．蛋白质溶解于合适的溶剂中，从中它能通过一种盐或有机化合物而析出。溶剂通常是水－缓冲剂溶液，有时加有机溶剂，如２－甲基－２，４－戊二醇（ＭＰＤ）。正常情况下，沉淀剂也被加入，但是浓度不高于使沉淀产生。对于不溶于水－缓冲剂或水－有机溶剂的膜蛋白，还需要加入去污剂。

３．使溶液过饱和。在这一步中，小聚集体形成，它是晶体生长所需的核。对小分子的结晶来说，相比于蛋白质更为人熟知，晶核的自发形成需要提供表面张力能。一旦这个能障被突破了，晶体开始生长。能障在高水平的过饱和度时很容易克服。因此，在高过饱和度时，晶核更易自发形成。晶核的形成可作为一个过饱和度和其他参数的函数通过多种方法来研究，包括光散射、荧光去极化及电子显微镜。

４．一旦晶核形成，晶体生长正式开始。对低分子量的化合物而言，新分子会逐步结合到正在生长的晶体表面。这是由于这些位置的结合能比较大，相对于分子结合到平滑的表面。这些步骤要么由晶系缺陷造成，要么发生在表面随机形成的晶核。

蛋白质结晶系列之二（自译）

理论告诉我们，最好的晶体生长要减少过饱和度到一个低的水平；维持高饱和度可能导致过多晶核的形成，从而产生很多小晶体（如图１．１）。同时，晶体需要缓慢地生长以在表面达到一个最高的有序度。然而实际中，并没有遵从这个基本规则。最简单的改变过饱和度的方式是改变温度或沉淀剂的浓度。

蛋白质沉淀可以通过添加盐、聚乙二醇或有机溶剂。作为沉淀剂，盐有双重作用，即盐析和盐溶。盐离子屏蔽了蛋白质分子表面的电荷，因此从而减弱了分子间的排斥力。此外，部分水被固定从而不可与蛋白质结合，因为盐离子周围形成水化层。最常用的盐是硫酸铵，其优点是溶解性好，对大多数蛋白质无损害，即使浓度很高。

聚乙二醇对水有高亲和性，能像盐那样固定水。而且，它以不同的方式影响蛋白质的溶解度。ＰＥＧ分子不能超过其半径而更接近蛋白质分子表面，蛋白质分子周围有ＰＥＧ中心不能接近的水化层。如果蛋白质分子聚集，这些水化层

部分重叠，从而不可接近的区域变小。结果，可接近区域变大。从而有更多的空间对ＰＥＧ分子可用，它们的熵增加（以一些蛋白质熵为代价），系统的自由能降低。因此，蛋白质分子聚集的这种情况在使用ＰＥＧ时是最有利的。

蛋白质结晶中最普遍的有机溶剂是ＭＰＤ。有机溶剂具有静电效应，它们能降低介质的的介电常数。静电力变强，从而压缩蛋白质分子周围离子的双电层。这些分子可以彼此更加接近，如果在一个有利的方向，它们便可以聚集。

一些蛋白质在水中溶解度不好，但是如果加入少量盐（比盐析少的多）就可溶解。移除盐后，蛋白质便会析出。这种盐溶效应可以解释为蛋白质分子表面带电基团和溶液中离子相互竞争的结果。在有溶剂离子时，蛋白质分子不会被离子双层包围，而能通过不同蛋白质分子上异种电荷之间的库仑力相互聚集。如果少量离子被加入，蛋白质周围会形成离子双层，它们彼此之间不扩散不排斥。

其他降低蛋白质溶解度的方法有改变溶液ｐＨ或温度。

综上所述，通常结晶蛋白质的步骤如下：

１．仔细检测纯度。

２．ａ．慢慢增加沉淀剂的浓度，如ＰＥＧ、盐或有机溶剂等。

ｂ．改变ｐＨ或温度。

实际中，通常可用作结晶实验的蛋白质的量非常少。要确定最好的结晶条件，经常需要进行大量的实验。因此，每次实验应该用最少量的蛋白质。一个合理大小（０．２×０．２×０．２ｍｍ＝０．００８ｍｍ３）的蛋白质晶体重约１０μｇ。因此，１ｍｇ纯化的蛋白质可以足够做大约１００次结晶实验。

膜蛋白在水中不溶解，因此很难结晶。通常的策略是使用洗涤剂将其溶解于水溶液中，然后采用水溶性蛋白的操作程序（Ｍｉｃｈｅｌ，１９９０；Ｓｏｗａｄｓｋｉ，１９９４）。Ｌａｎｄａｕ和Ｒｏｓｅｎｂｕｓｃｈ（１９９６）引进一种新的方法能够结晶膜蛋白。他们采用脂立方相作为各种化合物结晶的母体，脂立方相是具有立体对称性的液晶，它们能在脂和水的混合物中形成（ＬｉｎｄｂｌｏｍａｎｄＲｉｌｆｏｒｓ，１９８９）。一些类型的脂立方相是存在的。Ｌａｎｄａｕ等人（１９９７）成功地在某一类型脂立方相中生长出了高度有序的细菌视紫红质（ｂａｃｔｅｒｉｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）膜蛋白晶体（ｓｅｅａｌｓｏＧｏｕａｕｘ，１９９８）。但仍要看是否这种方法在结晶更多膜蛋白中取得成功。

科研中没有不可能的事！请看这里

１９７９年以前几乎没有人认为膜蛋白可以得到晶体，用于Ｘ射线衍射分析；德国科学家哈特姆特·米歇尔不信，他从７９年开始着手膜蛋白的结晶。结果，于１９８５年成功解析世界上第一个膜蛋白－紫细菌光合反应中心！于１９８８年获得诺贝尔化学奖。

离子通道被人们证实了多年，但一直未能得到其晶体结构。１９９８年，美国科学家麦克金龙等成功得到了钾通道的晶体结构，从而开辟了离子通道研究的新时代！于２００３年获得诺贝尔化学奖。

多年来人们一直认为β肾上腺素受体的晶体结构是不可能得到的，结果就在去年，美国科学家终于得到了！β肾上腺素受体属于Ｇ蛋白偶联的受体。当今，有５０％以上的药物的靶点都在Ｇ蛋白偶联的受体，可见其重要性。在人体内，Ｇ蛋白偶联受体是多种激素、神经递质等发挥作用所必不可少的！至今获得高分辨率解析的只有视紫红质和β１和β２肾上腺素受体，然而，Ｇ蛋白偶联受体家族有五大类共８００多种蛋白，看来要搞清楚这些还有很长一段路要走。同是在２００７年，１２月的一期Ｎａｔｕｒｅ杂志上刊登了一位科学家的三篇文章，分别是关于Ｎａ＋，Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ、Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ和

Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ的晶体结构及作用机制解析，这三者是在离子跨膜主动运输中发挥着“泵”的作用的三种重要的跨膜蛋白。

什么叫不可能？没有什么不可能！大家务必记住这一点！