材料和方法

2.1.材料

2.1.1.藜麦粉

（Chenopodium quinoa Willd.）由"Cooperativa Las Nieves"（智利VI地区）提供。面粉在4℃下储存直至使用。

2.1.2.壳聚糖

壳聚糖薄膜（Qo）。壳聚糖膜(Qo)脱乙酰度为88.5%的脱乙酰度为88.5%的壳聚糖膜(Qo)来自蟹壳的NMR-H1和600 kDa的Mwn，购自SigmaeAldrich,USA(C48165)。

壳聚糖纳米颗粒低分子量壳聚糖Qo(QoLMW)购自SigmaeAldrich,Inc.(St.Louis,MO,USA,C448869)，具有以下特性：比浓粘度(hsp/c)¼203(mL/g)，粘度平均值摩尔质量(Mv)=269 kDa，通过NMR-H1测量的脱乙酰度为78.3%（Lavertu等，2003）。特性粘度在0.1 M乙酸(HOAc)+0.2 M NaCl中以25℃测定。粘均分子量通过使用该溶剂中的MarkeHowink常数确定，K 1/4 1.81E?03 mL/g，a 1/4 0.93（Rinaudo,Milas,&Le Dung,1993;Tapia,Montezuma,&Yazdani-Pedram,2008）.

2.1.3.细菌菌株

金黄色葡萄球菌ATCC 25923（金黄色葡萄球菌）；大肠杆菌ATCC 25922（大肠杆菌）；铜绿假单胞菌ATCC 27853（铜绿假单胞菌）；S.enterica serovar Typhimurium ATCC 14028(S.typhimurium);产气肠杆菌ATCC 13048（产气肠杆菌）；和Listeria innocua ATCC 33090(L.innocua)从Instituto de Salud Pública,Santiago,Chile获得，用于抗菌活性测试。

2.2.印膜准备

2.2.1.EPQ的准备

EPQ根据Abugoch等人的方法制备。(2011)和Valenzuela等人。(2013)。藜麦粉悬浮在蒸馏水(18 g/100 mL)中，并用1 M NaOH将pH值调节至11。悬浮液在室温下搅拌60分钟，然后在21,000?g 15℃30分钟。根据布拉德福德方法（Bradford，1976）测量可溶性蛋白质含量并表示为蛋白质毫克数/毫升。EPQ是在每次需要时在使用前准备的。

2.2.2.Qo解决方案的制备

制备由1.5和2 g/100 mL Qo的柠檬酸(0.1 M)组成的溶液。将溶液超声30分钟（Fisher Scientific FS30H，德国）并在4℃下储存过夜以消除气泡。溶液在4℃下储存直至使用。

2.2.3.胶片准备

Qo薄膜由高分子量和高粘度Qo（1.5%和2.0%w/v柠檬酸在0.1 mol/L中）制成。将这些溶液(48.5±0.1 g)浇铸在低密度聚乙烯（直径1/4 8.5 cm）板上。在50℃下将薄膜干燥至恒重。从1.5%w/v的Qo溶液中获得的薄膜的表面固体密度为0.013 g固体cm-2次方。

Qo和EPQ的共混物是通过将在pH 11(6.7%w/v)和Qo（1.5%和2.0%w/v柠檬酸的0.1 mol/L）下获得的EPQ溶液以不同的Qo/EPQ比率（90:10、80:20、70:30、60:40和50:50%v/v)。将混合物的pH值调整为3.0（Valenzuela等人，2013年）。成型和干燥如对Qo所述进行。小心地从板上取下干燥的薄膜，并在测试前在22℃和60%的相对湿度下调节3天。从Qo/EPQ比为90:10的Qo(1.5%w/v)和EPQ混合获得的薄膜的表面固体密度为0.011 g固体cm?

2.2.3.NP制备

NQ是按照Calvo、Remu~n?an-L?opez、Vila-Jato和Alonso(1997)描述的程序制备的。在0.1 M柠檬酸中制备0.3%(w/v)QoLMW溶液并搅拌24小时。TPP制备的终浓度为1.0 mg/mL。将Qo溶液（输液泵KDS200，KD Scientific©）以2:1(v/v)TPP:Qo的比例逐滴加入TPP溶液(1.8 mL/min)并在室温下剧烈磁力搅拌（Calvo等等，1997）。所得悬浮液在21,000?g以14度离心30分钟（HermLe model Z32K，Wehingen，Germany）。

根据上述相同程序制备负载Th的Qo NPs(NQoThs)。制备Th(Sigma,USA,CT0501)溶液（0.1 M柠檬酸中的0.1%(w/v)）并将其添加到QoLMW溶液中。将Qo/Th溶液滴加到TPP溶液中。

2.4.NQoThs的油墨配方

使用两种不同的油墨配方将纳米颗粒印刷到可食用薄膜上。根据Buanz等人的方法，通过将4.4±0.1 mg/mL NQoThs以20%或30%(v/v)分散在甘油中制备含有NQoTh薄膜的墨水。(2011)。将油墨分散体超声处理(Fisher Scientific FS30H)30分钟并在环境温度下储存直至使用。

2.5.NP的表征

2.5.1.Zeta电位、PDI和粒子流体动力学直径

Zeta电位、PDI和粒子流体动力学直径使用Zetasizer Nano ZS-20（Malvern仪器）在4.0mW和633 nm下操作，固定散射角为173度，在25度下测量。在毛细管样品管内包含的NQos和NQoThs的10 mL溶液（20%和30%甘油，w/v）中评估样品。

2.5.2.粘度测量

使用Ostwald U型管粘度计（B号，Technico，英国）在温控水浴（25冷凝）（Grant Instruments Ltd.，Cambridge，UK）中测量粘度。蒸馏水用作参考。

2.5.3.表面张力测量

用Kibron微张力计（Kibron Inc.，Finland）使用50 mL样品溶液测量表面张力。该仪器用蒸馏水作为参考进行校准（表面张力¼72.8 mN m1次方，25负降温）（Buanz等，2011）。

2.5.4.透射电子显微镜(TEM)

飞利浦Tecnai 12 Bio Twin透射电子显微镜用于观察纳米颗粒的形态。将一滴纳米颗粒分散体涂在涂覆的铜网上，然后在室温下干燥，然后进行TEM分析。

2.5.5.接触角

基于滴落法(Kwok&Neumann,1999)评估Qo和Qo/EPQ薄膜上NQoTh分散体的接触角测量值(n=10)。用微量移液管(Gilson Pipetman U2)形成NQoTh分散体的小液滴(2.0 mL)。在将液滴放置在薄膜上30秒后，使用光学系统获取液滴的图像。光学系统由连接到CCD相机（Pulnix,Inc.,San Jose,CA,USA）的变焦视频镜头（Edmund Optics，NJ，USA）组成，使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院，美国）与插件Drop Shape Analysis(Drop-analysis,2011)。

2.6.使用NQoThs制作电影

所有实验均使用未经修改的Deskjet 4000k210热喷墨打印机（HewlettePackard Inc.）进行。黑色墨盒（型号HP 675，cn690A）通过切掉顶部，去除泡沫垫，用蒸馏水冲洗掉墨水，然后用无水乙醇冲洗掉。墨盒装有20 mL的NQoTh分散体，以印刷在Qo和Qo/EPQ薄膜上。打印模板为Word 2007（微软公司）编制的8.8*8.8平方厘米的面积。打印设置适用于提供的最高分辨率的黑色墨盒（600 dpi提供180 pL/drop，HewlettePackard Inc.，2012，Pagewide技术）。每次使用后，用蒸馏水和无水乙醇冲洗小柱（Buanz等，2011）。NQoThs由TIJ印刷在胶片上。该方法包括三个步骤。第一个是通过添加20%和30%(w/v)的甘油制备NQoThs的水分散体，这会减少溶质的结晶，防止打开锁定的打印头（Buanz等人，2011年），以及修改液体的表面张力和粘度（Khan等人，2010年；Kipphan，2001年）以确保NQoTh分散体作为微滴的适当递送。第二步和第三步包括将分散体放置在改进的打印头中，并将分散体打印在Qo和Qo/EPQ薄膜上。

对于Qo薄膜，印刷面积为77.44平方厘米，厚度为0.02厘米，印刷体积为1.56立方厘米。为此，使用了HewlettePackard 4000k210型打印机。打印参数是颜色选择（黑色墨水）和最大分辨率（600 dpi），这允许传送体积为180 pL的墨滴（HewlettePackard Inc.，Pagewide技术）。含20%和30%甘油的NQoThs的储备分散体中Th的初始浓度分别为120.15和105.13 ppm。

2.7.印刷Th的测量

印刷的可食用薄膜（16平方厘米）在3 mL 1 M HCl中研磨直至完全崩解，过滤（0.45 mm Durapore PVDF Millipore），在21,000?g 20℃30 min，正己烷萃取。根据Garsuch和Breitkreutz(2010)以及Pan、Chen、Davidson和Zhong(2014)的方法，通过紫外分光光度法在273 nm处测量上清液中的Th。

Th的理论和实验浓度使用以下公式计算：

理论计算

where

ThL ¼ Th Loaded in mg/cm3,

cd ¼ Th concentration in the dispersion of NQoThs, in mg,

dv ¼ drop volume in printing (resolution in dpi), in L/平方厘米,

PL ¼ number of printed layers on the film, and

t ¼ Film thickness, in cm.

实验计算

where

ThL ¼ Th Loaded, in mg/cm3,

cf ¼ Th concentration in the film, in mg,

Pa ¼ Printed area, in 平方厘米, and

t ¼ Film thickness, in cm.

掺入效率(%)

where:

IE ¼ Th incorporation efficiency (%),

EL ¼ Experimental Load, and

TL ¼ Theoretical Load.

2.8.薄膜结构特性

2.8.1.X射线衍射

X射线衍射是使用Siemens D-5000粉末X射线衍射仪和CuKa辐射（l 1.54埃；0.02度）进行的。选择1.7-80度的θ范围来分析晶体结构。对Qo和Qo/EPQ印刷薄膜进行X射线分析。

2.8.2.薄膜微结构

通过在Hitachi TM台式显微镜（软件TM3000）上的扫描电子显微镜（SEM）对所选薄膜的微观结构进行表征。在检查之前，使用双面胶带将薄膜安装在直径为10毫米的圆柱形模具中，然后在氩气气氛(PELCO 91000)中以20 kV的电压溅射镀金3分钟，以使其具有导电性。

2.8.3.薄膜的机械性能

拉伸机械性能在配备500 N称重传感器的万能拉伸试验机（LLOYD型号LR5K，英国）上测定。

拉伸强度(TS)和断裂伸长率(%E)使用智利官方标准方法(NCh1151,1999)测定，该方法等效于ISO R1184-1970标准方法。薄膜样品被切成10毫米？50毫米的条带，并使用双夹钳以30毫米的间隔以20毫米/分钟的测试速度进行测试。记录曲线载荷与伸长的关系，直到达到断裂伸长率。TS以MPa表示，并通过将最大载荷(N)除以横截面积(m2)计算得出。最大断裂伸长率或%E是通过将断裂时的伸长率除以样品的初始标距并乘以100来确定的。报告的TS和%E值是对每种类型的样品进行的至少四次测量的平均值电影。

2.8.4.厚度

薄膜厚度（mm）是在薄膜样品上确定的，并通过数字千分尺（Mitutoyo 293340）进行测量；每部电影平均得分为九分。

2.9.水蒸气渗透率(WVP)

WVP测量是根据智利官方标准方法(NCh2098,2000)进行的，该方法等效于ASTM D1653-93和DIN 52615标准方法，使用湿杯法并测试每个样品的六个薄膜。杯中装满蒸馏水至距顶部边缘6毫米的高度。用硅胶将薄膜密封在杯子上。将杯子置于冷藏相机中，温度为0±0.6℃，相对湿度为85±2%。称量杯子的重量直至恒重。WVP是从方程估计的。(4)根据McHugh、Avena-Bustillos和Krochta(1993)。

其中WVP=水蒸气渗透率，单位g mm m-2次方h-1次方Pa-1次方；ε=厚度mm；m=质量随时间的变化，单位为g；t=h中的时间；A=薄膜面积，m2；和DP=杯内薄膜表面的校正水蒸汽分压e柜内薄膜外表面的水蒸汽分压。

2.10.从印刷的可食用薄膜中释放纳米封装的Th

使用Franz连续垂直扩散池(Gilson Inc.Middleton,WI 53562)测定Qo和Qo/EPQ薄膜中NQoThs的释放。细胞的有效扩散面积为4.7平方厘米。将薄膜安装在受体和供体隔室之间（印刷面朝下）。接受室充满1.5mL蒸馏水并保持在20℃。每天从受体中取出1.5 mL样品。将流量调整为3 mL/天，持续8天。使用紫外分光光度计（见2.5）在273 nm处测定样品的Th。结果表示为每厘米3薄膜释放的Th毫克数。

2.11.抗菌活性

2.11.1.接种物的制备

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气大肠杆菌和无害李斯特菌分别在10 mL胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中在摇床中以37毫升培养24小时。细菌的光密度(OD)在标准McFarland标度上调整为0.5。获得的细胞最终浓度约为10-5次方—10-6次方CFU/mL。

2.11.2.NQo和NQoTh分散体的最小抑菌浓度(MIC)

评估了纳米颗粒对腐败细菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气大肠杆菌和无害乳杆菌生长的AM。

从储备分散体(4.4±0.1 mg/mL)制备NQoTh分散体的系列稀释液，直到浓度降低到10%。MIC被记录为在37℃（无浊度）Yoksan和Chirachanchai（2010）下孵育24小时后导致微生物无可见生长的最低浓度。

2.11.3.圆盘扩散法的抗菌活性

根据Bauer、Kirby、Sherris和Turck(1966)和NCCLS（国家临床实验室标准委员会，1990）。

将在20%甘油中印有NQoThs的两层薄膜切成6 mm2的圆盘（以获得3.0 mg/mm3 Th）并放置在接种有以下物质的悬浮液（0.1 mL of 106 CFU/mL）的Müller-Hinton琼脂平板表面上每个微生物。为了比较参数，使用未印刷的薄膜（对照）和在没有Th的情况下制备的在20%甘油中含有NQos的印刷薄膜。37℃培养24h，通过测量无微生物生长区域的直径来估计抑菌圈。

2.12.统计分析

每个实验至少进行3次，每次分析一式三份进行。通过方差分析对实验数据进行分析，并使用Tukey的多极差检验（Statgraphic 4.0版）测量平均值之间的显着差异。使用<0.05的p值来确定显着性。

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