二、实验

2.1 材料

二油酰磷脂酰胆碱 (DOPC)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸 (DPPS)、胆固醇 (Chol)、棕榈酰鞘磷脂 (pSM) 和亲脂性荧光探针 La-磷脂酰乙醇胺-N-（丽丝胺罗丹明 B 磺酰基）（铵 盐）（鸡蛋转磷脂酰化，鸡肉）购自 Avanti 极性脂质（阿拉巴斯特，阿拉巴马州）。

在 Cl3CH/CH3OH 2 : 1 v/v 中制备脂质混合物 得到 1 nmol mL 的溶液？ 1 总浓度与所有 所使用的溶剂和化学品具有最高的商业价值 纯度可用。 脂质单层和双层的制备 并在 (22 ? 1) 1C 的 0.145 M NaCl 亚相上表征 使用从 Milli-Q 系统 (Millipore) 获得的水，18 MO cm。

透射电子显微镜 (TEM) 网格用于 组装独立的平面双层获得 来自 SPI Supplies（美国西切斯特）。

2.2 方法

2.2.1 脂膜观察。

经典脂筏混合物 含有饱和脂质、不饱和脂质和胆固醇 被用来进行实验。 混合物 DOPC : pSM (1 : 1) + 25% Chol 和 DOPC : DPPS (1:2) + 20% Chol 选择用于中性和带电域的实验， 分别。 呈现相分离的组合物是 选择的目的是观察和跟踪领域 单层和双层的微米尺寸。 为了那个原因 目的是将 1 mol% 的荧光探针加入到 混合物。 由于荧光探针浓度较密 相较低，液相有序相中的域 (Lo) 在显微照片中显得更暗。 富集Lo相 每种混合物中的 pSM 和 Chol 或 DPPS 和 Chol。40-44

脂质单层的制备和表征使用 Langmuir 薄膜天平（微孔、Kibron、赫尔辛基、 芬兰）置于倒置荧光的舞台上 显微镜（Axiovert 200，Carl Zeiss，Oberkochen，德国），物镜为 20、40 或 100。 图像已注册 使用 CCD 摄像机（IxonEM+ 型号 DU-897，Andor 技术）。

独立的平面脂质双层是通过形成的 使用镀金 TEM 网格的 Langmuir-Blodgett 转移 3 毫米直径，带有 200 个六边形穿孔，每个穿孔 100 毫米。 金表面用十八烷基硫醇修饰 产生疏水性底物，如前所述。 39,45 在进行沉积之前，对网格进行了预处理 1 mL 4% v/v 十六烷的己烷溶液。 一次己烷 蒸发，剩余的十六烷提供适当的 双层形成的高原-吉布斯边界（圆环）。40,46,47 In 这样，含有所需混合物的单层被 压缩到 28 mN m? 1 ，然后表面压力为 在薄膜转移过程中保持恒定。 这个表面压力是 足够高以实现有效的薄膜转移，以及 低到仍然存在相分离，因为临界 这些混合物在 22 1C 的点接近 33 mN m? 1 . 这 底物通过脂质界面垂直下降，并平行于玻璃底部放置 槽，以便使用倒置的观察双层 显微镜。 双层保持在亚相下， 稳定了几个小时。

实验装置允许原位可视化 沉积后的单层和双层如图所示 图 1A。 单层的代表性图像和 还显示了双层。 中性单层的显微照片 图 1B 显示了在薄膜转移之前。 之后立马 其转移，双层荧光出现均匀 （见图 1C），但在 10-15 分钟后，相分离 观察到（图 1D 和 E）。 这个滞后时间是一致的 自发变薄过程所需的时间 由于溶剂从双层中间迁移到 支持边界。47,48 一些双层在 当电网容纳时转移或通过水通量 观察，可以在图 1C 的右下角观察到。 此外，中性和带电双层显示在 图1D和E分别。 分析的区域对应 总是在双层的中心以避免影响 由于靠近高原-吉布斯边界（方形 在图1E）。

图 1 用于生成和观察朗缪尔单层和平面独立双层的实验装置 (A)。 代表性图像显示 表面压力为 28 mN m 的中性朗缪尔单层膜？ 1 (B), 转移后立即包含多个同质双层 (C) 的网格, 和 突出显示的孔（C 中的插图）的放大图，以及显示相共存的中性 (D) 和带电双层 (E)。 橙色虚线方块 (E) 中显示的是用于分析的区域的示例。

应该注意的是，用于此的双层域 研究总是通过两个半层耦合，并且仅在 孤立的案例域出现解耦，如提议的那样 此域大小范围（参见 ESI，† S1）。49 域间斥力随着距离的减小而变化 在相似区域的域之间，这是通过 增加液体占据的总面积 ESI† (S2) 中详述的有序相 (%Lo)。

据我们所知，这是第一次，这种双层 在 TEM 网格上形成的系统用于查看和研究系统 呈现相分离。 注意优点之一 这个实验设置的一个特点是转移后，双层是 形成在网格的几乎所有孔中，允许分析 从单个实验中获得的多个双层，以及 改进数据采集和统计。

2.2.2 域跟踪和扩散测量。

在 为了获得域的扩散系数（D），对 小域（1-3 毫米半径）在视频中被跟踪 15–20 秒（150–200 帧，每帧 0.1 秒）如所述 50 软件程序 Image-J 用于执行 允许图像分割和插件"Mosaic Suite" 通过图像跟踪粒子。 51 有关更多详细信息 以及获得的图像分割和轨迹的示例 在对流阻力下，参见 ESI†（S3 和 S4）。

2.2.3 域和均值的径向分布函数 力相互作用势。

径向分布函数 g(r) 是为膜平面上的域计算的 双层和单层作为数量的函数 域，由有序液体的面积百分比量化 相状态，%Lo。 150帧的视频分为三个 部分，以及域中心之间距离的直方图 (r) 使用来自 50 个连续帧的数据构建，并且 报告的 g(r) 值是平均这些直方图的结果。

根据上述测定，平均力势为 计算依据：

其中 b 是 (kT)？ 1 和 w(r) 表示平均力势 域之间。 52 w(r) 曲线的第一个谷（其中 对应于 g(r) 曲线的第一个峰）被拟合为 二次函数和从它的曲率一个有效的弹簧 计算常数，用于量化 域间交互。

2.2.4 域合并。

以量化比率为目的 域的融合，双层和单层的视频是 拍摄 15-30 分钟，中间间隔 5 秒 帧。 相对于第一张显微照片计算了一段时间内的域数量，每个照片平均 12 张 分钟。 这些视频是针对 40%Lo 的膜拍摄的 所有系统，并在 28 mN m 的固定表面压力下？ 1 在 朗缪尔单层的情况。 时间零是在此刻设置的 在双层情况下的域外观，以及在点 达到了单层所需的表面压力。

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