2. 实验部分

2.1. 材料

纯重组人胰岛素、甲醇、氯仿和盐酸从MP Biomedical，LLC（Solon，OH）获得。 重组人胰岛素（Catalog#199744，99.3%分析）已在大肠杆菌表达系统中产生，并使用亲和纯化进行纯化。 所有化学品均为试剂级，使用时无需进一步纯化。 用于子阶段制备的水来自Modulab 2020水净化系统（德克萨斯州圣安东尼奥大陆水系统公司）。 纯化水的表面张力为72.6 mN·m − 1在20.0±0.5°C，电阻率为18 MΩ·cm，pH值为5.6时。

2.2. 方法

FITC人胰岛素结合程序。 通过FITC-HI的表观荧光检测HI-Langmuir单层的形貌。 由于胰岛素是非荧光的，所以必须附加一个荧光团才能使用荧光显微镜。 常用的蛋白质探针是异硫氰酸荧光素（FITC）。

FITC共轭HI的制备方法如下。 在PBS溶液中分别制备FITC（1 mg/mL）和HI（0.3 mg/mL）溶液。 用铝箔覆盖FITC溶液和任何含有FITC的溶液，以防止荧光探针的光降解。 将FITC溶液逐滴加入胰岛素溶液中并搅拌1小时。 这两种溶液在FITC与胰岛素的摩尔比为0.5:1至4:1的范围内相互混合。 搅拌后，溶液通过G-25 Sephadex柱（球状蛋白范围：1×103至5×103 Da）按以下顺序按重量分离：FITC-HI、HI和FITC。 当流经葡聚糖凝胶柱的其中一种组分的质量高于该范围时，这些组分将首先流出。 G-25葡聚糖凝胶的最大范围为5000da； 然而，HI的摩尔质量为5870 g mol − 1. 三个组成部分中有两个高于5000 Da，即HI-FITC和HI。 因此，最重的组分HI-FITC将首先流出色谱柱，然后流出HI。 最轻的成分是FITC和FITC碎片，它们保留在柱的顶部，如柱顶部的亮绿色发光所示。 柱上的紫外光显示三个不同区域：柱底部附近的荧光绿色区域，对应于FITC-HI，其上方的非荧光部分对应于未共轭于FITC的HI，以及柱顶部的荧光黄色区域，对应于未共轭于HI的FITC。 使用PBS缓冲液运行色谱柱，收集体积为1mL的等分试样。

荧光光谱法用于选择含有FITC-HI的小份样品。 FITC探针在494nm激发时显示出517nm的发射。 人们注意到，当探针与HI共轭时，FITC发射的强度增加。 吸收光谱法用于确定HI与FITC的比率，该比率由下式计算得出。21

其中MolWtHI=5870 g mol − 1和ε280，HI和ε495，FITC分别为17335和90000。 A495和A280分别是共轭物和HI在494和280 nm处的吸光度。 考虑到FITC在280 nm处的吸光度，校正系数为0.35×A495。 制备了各种共轭物（FITC x-HI），x代表每HI结合的FITC分子的平均数量。 一个已经准备好了1个 − 10个FITC分子与HI分子相连，但具有1个FITC分子的HI共轭物主要用于表观荧光显微镜实验。

朗缪尔单层制备。 Langmuir单层实验中使用的HI溶液浓度为0.30 mg/mL，通过将HI粉末溶解在盐酸水溶液（pH 2）中制备。 对于作为朗缪尔单层进行的所有实验，亚相（纯水）的pH值为5.6。 Kibron槽和KSV槽的铺展液体积分别为80和40μL。 HI溶液在空气中扩散 − 水界面，使用100μL注射器（Hamilton Co.，Reno，Nevada），在亚相表面均匀沉积小液滴，然后等待15分钟，以使Langmuir单层达到平衡。 压缩率设定为10mm·min − 1. 所有等温线和原位紫外光谱 − 在温度（20.0±0.5℃）和湿度（50±1%）保持恒定的洁净室（1000级）中进行可见光、荧光和辐照光谱测量。

表面化学和光谱学方法。 使用面积为5.9 cm×21.1 cm的Kibronμ-槽（Kibron Inc.，芬兰赫尔辛基）测量表面压力 − 面积（π） − A） 等温线 − 减压周期和稳定性研究。 表面电位 − 面积（ΔV − A） 使用由电容式系统组成的开尔文探针在Kibron槽上获得等温线。 振动板设置在朗缪尔单层表面上方约1 mm处，镀金槽底座用作对电极。

空气中的光谱测量 − 使用HP 8452 A型紫外分光光度计获得水界面 − vis和Fluorog-3荧光分光光度计（Horiba Scientific，爱迪生，新泽西州）用于荧光。 HI-Langmuir单层膜在空气中的荧光光谱 − 使用面积为0.25 cm2的分叉光纤测量水界面，并将其放置在亚相表面上方1 mm处。 激发光通过光纤从光源传输到朗缪尔单层膜，朗缪尔单层膜的发射光通过光纤传回检测器。 紫外线 − 在Perkin Elmer Lambda 900 UV/vis/NIR光谱仪（Norwalk，CT）和Fluorog-3荧光光谱仪（与用于Langmuir单层的荧光光谱仪相同）上分别使用1 cm光程长度的石英反应杯记录水溶液的可见吸收光谱和荧光光谱。

表观荧光显微镜用于观察Langmuir单层（如有）中区域的形成。 显微镜需要在样品台顶部放置朗缪尔槽。 石英窗允许激发光穿透亚相，以便在空气中激发荧光团 − 水界面。 实验装置使用Kibronμ-槽（Kibron Inc.，芬兰赫尔辛基）和荧光显微镜（Olympus IX-FLA）相结合。 可用于铺展溶液的面积为5.9 cm×21.1 cm。 该荧光图像由热电冷却光电Magnafire CCD相机拍摄。

布鲁斯特角显微镜（BAM）用于观察朗缪尔单层的形貌。 使用IElli-2000成像椭偏仪在关闭补偿器和BAM2plus软件的情况下进行测量。 IElli2000系统的标准激光器是倍频Nd:YAG激光器（50 mW输出），使用532 nm线。

使用JASCO J-810分光旋光仪获得圆二色性（CD）光谱。 在25°C下，使用2.0 mm光程长度的石英电池，在195和250 nm之间记录光谱。

水溶液的红外光谱是使用衰减总反射率获得的。 使用生物ATR辅助装置，将水样沉积在ATR晶体表面，很容易获得红外光谱。 静态模式只需要15分钟 − 20μL水溶液； 但是，水溶液的浓度应大于0.5 mg/mL，以确保与ATR晶体适当接触。 水银 − 镉 − 碲化物（MCT）探测器（Kolmar Technologies）的扫描速度为5 kHz。 背景光谱为纯水。 将生物ATR细胞II置于Bruker Optics Equinox55 FTIR的细胞室中。

红外反射 − 使用EQUINOX-55傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪（Bruker Optics，Billerica，MA）对Langmuir单层进行吸收光谱（IRRAS）测量，该光谱仪配备适用于空气的XA-511外部反射附件 − 水界面实验。 红外光束聚焦在空中 − Kibronμ-槽的水界面。 反射的红外光束进入了由液氮冷却的HgCdTe（MCT）探测器。 获得的光谱分辨率为8 cm − 1通过对1200个p极化扫描和800个s极化扫描的叠加。

人胰岛素的朗缪尔单分子层膜的表面化学和光谱学性质——摘要、介绍

人胰岛素的朗缪尔单分子层膜的表面化学和光谱学性质——实验部分

人胰岛素的朗缪尔单分子层膜的表面化学和光谱学性质——结果和讨论

人胰岛素的朗缪尔单分子层膜的表面化学和光谱学性质——结论、致谢！