晶体-细胞相互作用的蛋白质组学：肾结石研究的模型

肾结石/尿石症（即肾结石病）仍然是一个全球公共卫生问题，发病率/患病率不断上升。肾结石最常见的化学成分是草酸钙，它通过结晶、晶体生长、晶体聚集、晶体细胞粘附和通过肾间质中的细胞外基质侵入来引发结石形成。在这些过程中，晶体-细胞相互作用（定义为“细胞通过粘附在细胞表面或内化到细胞中的晶体的任何方式的影响而改变细胞的现象，伴随着晶体的变化，例如，细胞诱导的生长，粘合能力，降解等”）对于晶体在肾脏中的保留非常重要。在过去的12年中，蛋白质组学已广泛应用于肾结石研究，旨在更好地了解肾结石形成的致病机制。本文概述了该领域的当前知识，并总结了从所有将蛋白质组学应用于晶体-细胞相互作用研究的研究中获得的数据，这些研究随后导致了功能研究，以解决表达蛋白质组学数据在肾结石疾病发病机制中的显着影响或功能作用。

1.引言

肾结石病仍然是一种常见的人类疾病，在全球发达国家和发展中国家都可以找到[1，2，3]。肾结石主要由含钙晶体组成，特别是草酸钙（CaOx）一水合物（COM）和二水合钙（COD）[1，2，3]。肾结石形成的机制过程相当复杂，涉及结晶、晶体生长、晶体聚集、晶体细胞粘附以及通过肾间质中的细胞外基质（ECM）侵入晶体[4，5，6]。结晶既可以在肾小管内（管内模型）内发生，也可以发生在肾间质（兰德尔斑块模型）[4，5，6]。晶体形成后，单个晶体通过晶体生长或聚集机制成为较大的颗粒[7，8]。此外，晶体-细胞粘附导致晶体潴留到肾小管或间质内[9，10]。粘附的晶体可以内化到肾小管细胞中进行降解，反之亦然，通过炎症级联反应进一步增强结石形成过程[11，12]。最后，在肾间质中形成的内化晶体可以使用纤溶酶-纤溶酶原途径[13]通过ECM侵入或迁移到其他部位，随后引发组织炎症和侵蚀[14，15]。

有趣的是，晶体保留和结石形成的关键过程之一是晶体-细胞粘附步骤，需要“晶体-细胞相互作用”，这可以在这里定义为细胞被粘附在细胞表面或内化到细胞中的晶体的任何影响而改变的现象，伴随着晶体的变化，例如，细胞诱导的生长、粘合能力、降解等。使用术语“相互作用”是通过晶体和细胞之间的“相互作用”来逻辑的。很明显，晶体可以引起细胞中的许多变化，从轻度到重度细胞毒性[14，15，16]。另一方面，细胞的组成，特别是在顶端表面和内吞囊泡中，会影响晶体的生长，粘合能力和降解[17，18]。这种相互作用可以增强肾内晶体的保留和晶体进入肾小管细胞的内吞作用。此外，晶体-细胞相互作用也可导致肾小管细胞损伤和炎症级联反应，从而进一步增强结石形成过程[14，15，16]。

在蛋白质组学时代，蛋白质组学已被广泛应用于各种肾脏疾病[19，20，21]。在过去的12年中，蛋白质组学已广泛应用于肾结石疾病（尤其是COM和COD类型）的研究，旨在更好地了解肾结石形成的致病机制[22，23]。本文总结了所有将蛋白质组学应用于晶体-细胞相互作用研究的研究，这些研究随后导致了功能研究，以解决表达蛋白质组学数据在肾结石疾病发病机制中的显着影响或功能作用。请注意，这些研究应用蛋白质组学从结石形成者中鉴定尿液或肾结石基质中的蛋白质，而没有任何证据表明“晶体-细胞相互作用”（见上面的定义），被排除在本评价之外（因为其中许多蛋白质只是与尿液中的结石调节剂混合，或者只是在结石肿大期间通过停滞卡在结石基质内，而在结石发病机制中没有任何作用）。肾结石研究中与CaOx晶体-细胞相互作用的蛋白质组学相关的所有相关研究总结在表1并讨论如下。

表1与CaOx晶体-细胞相互作用的蛋白质组学相关的所有相关研究摘要。

年作者/参考文献晶体-细胞相互作用的条件蛋白质组学技术/功能检测主要发现不同剂量和类型的CaOx晶体对肾小管细胞细胞蛋白质组的影响2008塞曼戈恩等[24]细胞：MDCK细胞（全细胞）

晶体：100μg/mL COM

培养：48小时2-DE，西普罗红宝石染色，Q-TOF质谱和质谱/质谱11种上调和5种下调蛋白质，在转录/翻译，信号转导，细胞代谢和生长，核和细胞结构，运输，应激反应和生物合成中发挥作用。2008通布克德五世等[25]]细胞：MDCK细胞（全细胞）

晶体：1000μg/mL COM孵育：48小时2-DE，西普罗红宝石染色，Q-TOF质谱和质谱/质谱鉴定出25种上调和23种下调蛋白质。当伴侣被上调时，参与蛋白质合成，细胞周期调节，细胞结构和细胞信号传导的其他蛋白质被下调。2008塞曼戈恩T等[26]细胞：MDCK细胞（全细胞）

晶体：100μg/mL COD

孵育：48小时2-DE，西普罗红宝石染色，Q-TOF质谱和质谱/质谱5种上调和5种下调蛋白质，控制细胞代谢，结构，完整性，信号转导和应激反应。2010陈S等[27]]细胞：HK-2细胞（全细胞）

晶体：200μg/mL COM

培养：12小时2-DE银二胺染色，LC-静电放电微粒/微粒9种上调和3种下调蛋白质，在能量产生，细胞增殖，细胞凋亡，应激反应，钙平衡和蛋白质合成中起作用。2011蒋宗华等[28]细胞：MDCK细胞（全细胞）

晶体：100μg/mL COD

孵育：48小时2-DE、Pro-Q祖母绿糖蛋白染色、西普罗红宝石总蛋白染色、Q-TOF质谱和质谱/质谱在16种显著改变的糖蛋白中，3个蛋白酶体亚基的糖型上调，而肌动蛋白相关蛋白3（ARP3）的糖型下调。2012柴亚里特S等[29]细胞：MDCK细胞（纯化的线粒体）

晶体：100微克/毫升COM

孵育：48小时2-DE，深紫色染色，Q-TOF质谱和质谱/质谱，氧合分印迹测定12种上调和3种下调线粒体蛋白，调节细胞结构，新陈代谢和能量产生。COM晶体还诱导线粒体功能障碍和氧化修饰蛋白在细胞中的积累。2017维奈法特A等[30]细胞：MDCK细胞（全细胞）

晶体：100/1000μg/mL COD/COM

培养：48小时蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，荧光素-荧光素酶ATP测定，氧化印迹测定，泛素化蛋白质的测量，细胞死亡测定和晶体-细胞粘附测定与低剂量相比，高剂量的这些晶体引起细胞蛋白质组更明显的变化，并且COM比COD更有效地诱导细胞蛋白质组的改变。用高剂量处理的细胞具有更高水平的细胞内ATP，氧化修饰蛋白和细胞死亡，但泛素化蛋白水平较低。COM也诱发比COD更严重的细胞毒性。用抗氧化剂EGCG对细胞进行预处理可以降低晶体诱导的氧化修饰蛋白的积累和细胞的晶体结合能力。2018皮拉彭P等[31]]细胞：MDCK细胞（全细胞）

晶体：1000μg/mL COM孵育：48小时蛋白质-蛋白质相互作用网络分析、增殖测定、伤口愈合测定、氧化印迹测定、荧光素-荧光素酶ATP测定和经上皮耐药性（TER）测量用1000μg/mL COM晶体处理的细胞毒性细胞在细胞增殖，伤口愈合能力，TER以及紧密连接蛋白zonula闭塞-1（ZO-1）和信号蛋白RhoA的水平方面存在降低。相反，细胞内ATP和氧化修饰蛋白的水平升高。肾小管细胞顶端表面COM晶体受体的蛋白质组鉴定2011方恩根等[32]细胞：MDCK细胞（纯化的顶端膜）

晶体：COM

孵育：过夜甲基纤维素/质谱、Q-TOF质谱和质谱/质谱、晶体细胞粘附测定、抗体中和测定共鉴定出96个潜在的COM晶体受体。膜联蛋白II作为COM晶体受体的作用通过使用特异性抗体的中和测定得到证实。2012舒替蓬坦酸S等[33]]细胞：MDCK细胞（全细胞和纯化的顶膜）

晶体：100μg/mL COM

孵育：30分钟，72小时2-DE、西普鲁比红宝石染色、Q-TOF质谱和质谱分析、晶体-细胞粘附测定、钙诱导测定、抗体中和测定膜联蛋白A1作为COM晶体受体。2013坎拉亚R等[34]]细胞：MDCK细胞（全细胞和纯化的顶膜）

晶体：100μg/mL COM

培养：30分钟，72小时2-DE、西普罗红宝石染色、Q-TOF质谱和质谱/质谱、晶体细胞粘附测定、草酸盐诱导试验、抗体中和测定A-烯醇化酶作为COM晶体受体。2016皮拉彭P等[35]]细胞：MDCK细胞（全细胞和纯化的顶膜）

晶体：100μg/mL COM

孵育：30分钟晶体-细胞粘附测定、钙诱导测定膜联蛋白A1作为COM晶体受体。2016方恩根等[36]细胞：MDCK细胞（整个细胞和纯化的顶膜）

晶体：100μg/mL COM

孵育：1小时晶体细胞粘附测定、抗体中和测定A-烯醇化酶作为COM晶体受体。2016方恩根等[37]细胞：MDCK细胞（全细胞和纯化的顶膜）

晶体：100μg/mL COM

培养：1小时，48小时晶体-细胞粘附测定、晶体内化测定、抗体中和测定、小干扰RNA（siRNA）敲低蛋白质HSP90用作COM晶体受体。2016马尼索恩J等[38]]细胞：MDCK细胞（全细胞和纯化的顶膜）

晶体：100μg/mL COM

孵育：30分钟晶体-细胞粘附测定、蛋白质过表达、草酸盐诱导测定A-微管蛋白过表达导致三种COM晶体受体的下调，包括α烯醇化酶，HSP70和HSP90，并降低了细胞的晶体结合能力。2016彭萨库尔N等[39]]细胞：MDCK细胞（全细胞）

晶体：100μg/mL COM

孵育：30分钟晶体-细胞粘附测定、siRNA蛋白质敲低、草酸盐诱导测定层粘连蛋白A/C敲低导致四种COM晶体受体的水平降低，包括维生素A，α烯醇化酶，S100和膜联蛋白A2，并且细胞的晶体结合能力下降。2018马尼索恩J等[40]]细胞：HEK293T细胞（全细胞）

晶体：100μg/mL COM

培养：1小时晶体-细胞粘附测定，通过siRNA敲低蛋白质HSP90用作COM晶体受体。2018维奈法特A等[41]细胞：MDCK细胞（整个细胞和纯化的顶膜）

晶体：100μg/mL COM

孵育：1小时晶体-细胞粘附测定、晶体内化测定、抗体中和测定PMCA2用作COM晶体受体。COM晶体对单核细胞和巨噬细胞细胞蛋白质组的影响2010辛格托N等[42]细胞：U937细胞（全细胞）

晶体：100μg/mL COM

培养：24小时2-DE，深紫色染色，Q-TOF质谱和质谱/质谱9种上调蛋白质和13种下调蛋白质，在细胞周期，细胞结构，碳水化合物代谢，脂质代谢，mRNA加工以及蛋白质合成，稳定和降解中起作用。2013辛格托N等[43]]细胞：人巨噬细胞（全细胞）

晶体：100μg/mL COM

孵育：24小时2-DE，深紫色染色，Q-TOF质谱和质谱/质谱，吞噬作用测定，通过SIRNA敲低蛋白质7种上调和7种下调蛋白质，控制细胞结构，碳水化合物代谢，DNA/RNA加工，蛋白质代谢，分子运输和应激反应。HSP90在巨噬细胞的吞噬体形成和吞噬活性中起着至关重要的作用。COM晶体对分泌组和外泌体蛋白质组的影响2016蒋宗华等[13]细胞：MDCK细胞（分泌组）

晶体：100μg/mL COM

培养：20小时2-DE，深紫色染色，Q-TOF MS/MS，晶体迁移测定，细胞迁移测定COM晶体诱导2个来自肾小管细胞的分泌蛋白增加和4个减少。分泌性烯醇化酶-1的增加反过来又通过ECM增强了COM晶体的侵入。2016辛提普伦格拉特K等[44]]细胞：U937细胞（分泌组）

晶体：100μg/mL COM

孵育：16小时2-DE，深紫色染色，Q-TOF质谱和质谱/质谱COM晶体诱导了14个与U937单核细胞免疫反应和细胞存活相关的分泌蛋白增加和4个减少。增加的HSP90局限于细胞表面。2018辛格托N等[45]细胞：人巨噬细胞（外泌体）

晶体：100μg/mL COM

孵育：24小时2-DE，深紫色染色，纳米LC-ESI-ETD MS/MS，细胞迁移测定，吞噬作用测定，通过siRNA敲低蛋白质2种上调和4种下调外泌体蛋白。来自晶体相互作用的巨噬细胞的外泌体诱导单核细胞的迁移/活化和巨噬细胞的吞噬活性。siRNA敲低了维生素素，成功地抑制了来自COM晶体暴露巨噬细胞的外泌体的这种作用。2018辛格托N等[46]细胞：人巨噬细胞（外泌体）

晶体：100μg/mL COM

孵育：24小时纳米LC-ESI-Qq-TOF，细胞迁移试验，晶体结合试验，晶体迁移试验7种上调和19种下调外泌体蛋白。来自晶体相互作用巨噬细胞的外泌体诱导中性粒细胞迁移，增强肾小管细胞中促炎细胞因子IL-8的产生，与COM晶体具有更大的结合能力，并通过ECM激活晶体入侵。

2.不同剂量和类型的CaOx晶体对肾小管细胞细胞蛋白质组的影响

应用于晶体-细胞相互作用的蛋白质组学的首次研究是在2008年完成的[24]。在这项工作中，仔细建立了研究模型，表明剂量为100μg/mL（每体积培养基）的COM晶体在48小时的潜伏期不会对肾小管细胞造成严重的细胞毒性，并且细胞死亡百分比不会增加。因此，由COM晶体诱导的细胞蛋白质组的变化反映了细胞对COM晶体的反应，而不是它们的细胞毒性作用。此外，扫描电子显微镜（SEM）在与细胞孵育后显示出COM晶体边界的扭曲，首次表明晶体-细胞相互作用具有直接的实验证据。使用二维凝胶电泳（2-DE）与Sypro Ruby荧光染色，然后进行四极杆飞行时间（Q-TOF）质谱（MS）和串联MS（MS/MS），鉴定了11种上调和5种下调蛋白质，它们在转录/翻译，信号转导，细胞代谢和生长，核和细胞结构，运输，应激反应和生物合成中起作用。其中一些蛋白质组学数据通过二维（2-D）蛋白质印迹得到证实[24]。

随后，进行了一项亚细胞蛋白质组研究[29]，以评估100μg/mL COM晶体对线粒体蛋白质组的影响以及使用高度纯化的线粒体分离方法暴露于晶体48小时的肾小管细胞的功能[47]。使用2-DE与深紫色荧光染色的比较分析，然后是Q-TOF MS和MS/MS分析，确定了12种上调和3种下调线粒体蛋白，它们调节细胞结构，代谢和能量产生。此外，Oxyblot检测表明，COM晶体诱导线粒体功能障碍和氧化修饰蛋白在细胞中的积累[29]。

另一项使用较高剂量（200μg/mL）COM晶体的研究显示，当肾小管细胞与COM晶体和2 mM草酸盐一起孵育较短时间（仅12小时）时，细胞死亡不会增加[27]。使用2-DE银染色，然后液相色谱法结合电喷雾电离MS/MS（LC-ESI MS/MS），数据显示9种上调和3种下调细胞蛋白，其作用于能量产生，细胞增殖，凋亡，应激反应，钙平衡和蛋白质合成。

使用高得多剂量（1000μg/mL）的COM晶体，细胞在与晶体孵育48小时后，细胞发生严重细胞毒性，总细胞死亡增加[25]。使用2-DE与西普罗红宝石染色，然后进行Q-TOF MS和MS/MS分析，鉴定出25种上调和23种下调蛋白。EZRIN、烯醇化酶-1和膜联蛋白-A1水平的降低通过2-D蛋白质印迹得到证实。有趣的是，伴侣被上调，而其他参与蛋白质合成、细胞周期调控、细胞结构和细胞信号传导的蛋白质被下调[25]。最近使用各种测定方法进行了功能研究，以确定该表达蛋白质组学数据集的生物学相关性[31]。最初，所有显着改变的蛋白质被提交给STRING生物信息学工具[48]以获得蛋白质-蛋白质相互作用网络，其揭示了细胞增殖/伤口愈合，氧化应激/线粒体功能以及细胞连接复合物/完整性是显着改变蛋白质的主要生物学功能。验证实验表明，用1000μg/mL COM晶体处理的细胞毒性肾小管细胞在细胞增殖、伤口愈合能力、经上皮阻力（TER）以及闭塞-1（ZO-1）和信号蛋白RhoA的紧密连接蛋白水平方面均有所下降。相反，氧化修饰蛋白的水平升高。虽然ATP合酶α亚基前体减少，但参与能量产生和稳态的其他线粒体蛋白（例如乌头酶、腺苷酸激酶2、泛醇-细胞色素-c还原酶）增加[25]。结果，COM处理的细胞中的细胞内ATP水平升高[31]。这些数据可能反映了COM晶体诱导的微管毒性期间发生的细胞过程[31]。

蛋白质组学还应用于研究暴露于无毒剂量（100μg/mL）的COD晶体48小时后肾小管细胞细胞蛋白质组的变化[26]。使用2-DE和Sypro Ruby染色，然后进行Q-TOF MS和MS/MS分析，数据显示5种上调和5种下调蛋白质控制细胞代谢、结构、完整性、信号转导和应激反应[26]。随后，研究了100μg/mL COD晶体诱导的肾小管细胞糖蛋白组的变化[28]。使用2-DE和Pro-Q祖母绿糖蛋白染色，然后使用Sypro Ruby总蛋白染色进行归一化，Q-TOF MS和MS/MS鉴定了16个显着改变的糖蛋白，包括负责调节细胞-细胞解离的3个蛋白酶体亚基的糖型和在细胞完整性中起作用的肌动蛋白相关蛋白3（ARP3）。这些数据表明，COD晶体导致细胞解离并降低细胞完整性[28]。

此外，还对暴露于不同剂量和类型的CaOx晶体后肾小管细胞的功能扰动进行了比较分析[30]。表达数据的比较表明，与低剂量相比，这些晶体的高剂量引起细胞蛋白质组更明显的变化，并且COM比COD更有效地诱导细胞蛋白质组的改变。功能分析显示，在用高剂量COM和COD处理的细胞中，细胞内ATP，氧化修饰蛋白和细胞死亡水平较高，但泛素化蛋白水平较低。COM晶体也诱导比COD更严重的细胞毒性。用抗氧化剂表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对细胞进行预处理可以降低晶体诱导的氧化修饰蛋白的积累和细胞的晶体结合能力。这些数据强调了高剂量与低剂量以及COM与COD晶体在肾小管细胞中诱导功能性扰动的差异效应。研究结果还表明，氧化应激可能在用这些不同剂量/类型的晶体处理的细胞的晶体结合能力中起重要作用[30]。

然而，应该注意的是，COM/COD晶体的剂量及其暴露于所有上述体外研究中应用的细胞的时间可能并不完全代表结石成型剂中的体内状况，这可能伴随着肾结石发病机制的另一个模型，即Randall的斑块模型。目前，晶体-细胞相互作用的体内研究似乎尚未用于肾结石研究，因为限制（实际上缺乏）跟踪体内晶体-细胞相互作用的技术。当这种技术可用时，肾结石形成的致病机制将更加清晰。

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3.肾小管细胞顶端表面COM晶体受体的蛋白质组学鉴定

肾结石研究在细胞水平上取得重大飞跃的另一步是开发一种简单但有效的剥离方法来分离和纯化极化肾小管细胞的顶膜[49]。这种新方法主要依赖于所施加的表面（例如，Whatman滤纸，硝酸纤维素膜，玻璃纸或玻璃盖玻片）的吸附能力，以利用这些表面和顶端膜之间的含水亲和力和离子相互作用与顶端膜粘附。在测试的这4个表面中，滤纸是分离和纯化顶端膜的最有效一种，而基底外侧膜蛋白没有任何污染，这已通过免疫印迹和免疫荧光染色证实[49]。与传统的生化测定（主要使用基于离心的方法）相比，剥离方法在分离/纯化顶端膜方面要有效得多。

该剥离方法用于分离极化肾小管细胞顶膜的高度纯化部分，然后鉴定细胞表面的潜在COM晶体受体[32]。将回收的蛋白质重悬于人工尿液中，并与COM晶体一起孵育过夜。洗涤和洗脱后，凝胶增强液相色谱法，然后串联MS（GeLC-MS/MS）共鉴定出96个潜在的COM晶体受体。其中，膜联蛋白II作为COM晶体受体的作用通过晶体-细胞粘附试验验证，然后使用特异性抗膜联蛋白II抗体进行中和[32]。此外，其他COM晶体受体也在随后的研究中得到证实，包括α烯醇化酶[34，36]、膜联蛋白A1[33，35]、热休克蛋白90（HSP90）[37，40]和质膜Ca2+异肽酶2（PMCA2）[41]。

其他不作为COM晶体受体但其作用与各种COM晶体受体相关的蛋白质，包括α-微管蛋白和层粘连蛋白A/C.A-微管蛋白（一种细胞骨架蛋白）被鉴定为使用蛋白质组学方法用1000μg/mL COM晶体处理的肾小管细胞中的下调蛋白质之一[25]，并作为蛋白质-蛋白质相互作用网络的中心节点[38]].α-微管蛋白的过表达导致3种COM晶体受体的下调，包括α烯醇化酶、热休克蛋白70（HSP70）和HSP90，并且细胞的晶体结合能力下降[38]。相比之下，另一项蛋白质组学研究发现，层粘连蛋白A/C（一种核层蛋白）是用100μg/mL COM晶体处理的肾小管细胞中的上调蛋白质之一[24]，并作为蛋白质-蛋白质相互作用网络的中心节点[39]。小干扰RNA（siRNA）敲低层粘连蛋白A/C导致4种COM晶体受体（包括维门汀、α烯醇化酶、S100和膜联蛋白A2）的水平降低，并且细胞的晶体结合能力下降[39]。这些数据表明，层粘连蛋白A/C具有各种功能，包括调节其他蛋白质的表达。对上述COM晶体受体及其调节剂或相关蛋白质的表征可能导致进一步发展策略，通过阻断COM晶体粘附在细胞上和晶体保留在肾内来防止肾结石的形成。

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4.COM晶体对单核细胞和巨噬细胞细胞蛋白质组的影响

CaOx晶体不仅与肾小管细胞相互作用，还与单核细胞和巨噬细胞相互作用，它们在进一步加重肾结石形成的炎症过程中起重要作用。因此，蛋白质组研究已经研究了单核细胞/巨噬细胞响应COM晶体的作用。将人单核细胞U937细胞与100μg/mL COM晶体一起孵育24小时，并检查细胞蛋白质组的变化[42]。使用2-DE进行深紫色荧光染色，然后进行Q-TOF MS和MS/MS分析，结果显示9种蛋白质的水平升高，13种蛋白质的水平降低，这些蛋白质在细胞周期、细胞结构、碳水化合物代谢、脂质代谢、mRNA加工以及蛋白质合成、稳定和降解中的作用[42]。

后来，采用类似的方法研究人巨噬细胞与100μg/mL COM晶体相互作用24小时后细胞蛋白质组的变化[43]。比较蛋白质组分析揭示了7种上调和7种下调蛋白质，它们控制细胞结构，碳水化合物代谢，DNA/RNA加工，蛋白质代谢，分子运输和应激反应。有趣的是，蛋白-蛋白相互作用网络分析表明，HSP90直接与β肌动蛋白和α微管蛋白相互作用，所有这些相互作用的伙伴在COM处理的巨噬细胞中都上调。功能研究表明，只有肌动蛋白与HSP90共定位在被吞噬的COM晶体周围，形成吞噬体结构。siRNA对HSP90的敲低抑制了吞噬体的形成以及COM晶体诱导的巨噬细胞的吞噬和迁移活性。这些数据表明，HSP90不仅作为COM晶体受体，而且在巨噬细胞的吞噬体形成和吞噬活性中也起着至关重要的作用[43]。

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5.COM晶体对分泌组和外泌体蛋白质组的影响

除了COM晶体诱导的细胞蛋白质组的改变外，还使用蛋白质组学方法研究了晶体-细胞相互作用对分泌组的影响。对于肾小管细胞，100μg/mL COM晶体导致2种分泌蛋白水平升高，4种分泌蛋白水平降低[13]。有趣的是，使用先前建立的基于纤溶酶原-纤溶酶活性的晶体迁移测定法进行了功能研究[50]。数据显示，分泌性烯醇化酶-1的增加反过来又通过ECM促进COM晶体侵袭和单核细胞的迁移[13]。对于人单核细胞，用U937单核细胞孵育100μg/mL COM晶体16 h可诱导细胞中14个分泌蛋白增加和4个减少[44]。有趣的是，一项免疫荧光研究检测到细胞表面的HSP90增加，这表明其增加的分泌可能来自非经典分泌途径[44]。

为了证实COM可以通过非经典分泌途径诱导分泌组的变化，随后的研究调查了来自人类巨噬细胞的外泌体蛋白质组的改变。使用基于凝胶的[45]和无凝胶[46]定量蛋白质组学方法，鉴定出许多显着改变的外泌体蛋白。有趣的是，暴露于COM晶体的巨噬细胞产生更高水平的白细胞介素-1β（IL-1β），这是炎症小体活化标志物之一[51，52]。此外，来自这些晶体相互作用巨噬细胞的外泌体诱导单核细胞的迁移/活化，单核细胞产生更高水平的白细胞介素-8（IL-8）（一种促炎细胞因子），其作为旁分泌激活巨噬细胞的吞噬活性[45]。siRNA敲低了一种上调蛋白（维门汀），成功地抑制了来自COM晶体暴露巨噬细胞的外泌体的这种作用[45]。此外，来自这些晶体相互作用巨噬细胞的外泌体诱导中性粒细胞迁移，增强肾小管细胞中促炎细胞因子IL-8的产生，与COM晶体的结合能力更强，并通过ECM激活晶体入侵[46]。

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6.结论

在过去的12年中，蛋白质组学已成功应用于肾结石研究，旨在更好地了解肾结石形成的致病机制，特别是在晶体-细胞相互作用（表1).这些研究的第一阶段主要涉及与COM晶体相互作用后肾小管细胞中改变的全细胞蛋白质组的表征。随后，亚细胞蛋白质组学揭示了细胞与COM晶体相互作用后线粒体蛋白质组变化和线粒体功能障碍的其他信息。此外，对不同剂量和类型的CaOx晶体对肾小管细胞细胞蛋白质组的影响的功能研究，使得更好地理解受晶体-细胞相互作用影响的肾小管细胞的表达和功能扰动（见第2节）。在开发出一种简单而高效的方法来从极化的肾小管细胞中纯化顶膜之后，该领域发生了一个巨大的飞跃。特别是，蛋白质组学鉴定了大量潜在的COM晶体受体，然后在随后的几项研究中进行了功能验证。这些发现对于进一步制定通过阻断致病晶体与靶肾小管细胞之间的结合来预防肾结石形成的策略非常重要（见第3节）。除肾小管细胞外，蛋白质组学还应用于研究人单核细胞/巨噬细胞细胞蛋白质组的变化，这些变化导致更清楚地了解消除粘附和内化CaOx晶体和炎症反应的机制（见第4节）。此外，还开发了几种功能测定方法，以解决从蛋白质组学研究的初始阶段鉴定的表达数据的功能意义。例如，鉴定由COM晶体诱导的改变的分泌蛋白，这反过来又加剧了通过ECM的晶体入侵。最后，最近关于巨噬细胞外泌体在肾结石形成炎症级联中的作用的知识提供了额外的新信息，以更好地了解晶体-细胞相互作用期间的炎症级联反应（见第5节）。综上所述，所有这些发现都有助于更好地了解肾结石病的致病机制，特别是在晶体-细胞相互作用的步骤中。此外，这些发现还可能导致开发新的策略来预防新的和/或复发的肾结石的形成。