经过一次、二次常规采油之后，遗留在地层的残余油仍然占石油总量的60%～70%。如何最大限度地开采出地下剩余的原油，已经成为石油工业的重要任务。Zobell在1946年发表了利用微生物提高石油采收率的专利，并发现微生物提高石油采收率的机理之一是微生物代谢过程中产生了生物表面活性剂。产生表面活性剂的微生物种类很多，如酵母菌、真菌、细菌等。能以原油组分为碳源和能源产生生物表面活性剂的微生物，是微生物采油的首选菌种。现已知的能应用于微生物采油的菌种有近30个属100多种。利用不同的培养基对不同的菌种进行培养、驯化，获得了可以产生大量表面活性剂、对稠油具有较强的分散、乳化作用的菌种。从污水中分离到的一株地衣芽孢杆菌可以耐受高温和高浓度盐，且对原油具有较强的乳化、增溶和降黏作用。Ghojavand等在兼性厌氧条件下筛选出耐高温(60℃)、高矿化度(15%NaCl)的枯草芽孢杆菌，该菌对原油具有较强的降黏作用。研究生物表面活性剂产生菌在微生物采油过程中的生长规律，探讨其作用机理，对微生物采油技术的改进和完善具有十分重要的理论和实际意义。

本研究通过原油平板培养法，筛选出3株生物表面活性剂产生菌，对各菌株进行生理生化试验和初步鉴定；测定各菌株在发酵过程中发酵液表面张力、pH、菌体密度和细胞疏水性等特征参数；对各菌株产生的生物表面活性剂组成进行分析。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌源

盘锦油田被原油污染的土壤。

1.2方法

1.2.1培养基及其制备方法

液体富集培养基(g/L)：原油3.0，NaCl 3.0，NH4Cl 0.1，MgSO40.02，NaNO30.2，KH2PO40.1，K2HPO40.2，pH 7.0。于1.03×105Pa灭菌30 min。

平板富集培养基(g/L)：原油3.0，蛋白胨5.0，琼脂20.0，NaCl 3.0，NH4Cl 0.1，MgSO40.02，NaNO30.2，KH2PO40.1，K2HPO40.2，pH 7.0。于1.03×105Pa灭菌30 min。

平板分离及保藏培养基(g/L)：葡萄糖3.0，蛋白胨8.0，酵母膏3.0，KH2PO42.7，NaCl 5.0，琼脂20.0，pH 7.0。于0.8×105Pa灭菌30 min。

种子培养基(g/L)：NaCl 5.0，牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，pH 7.0，于1.03×105Pa灭菌30 min。

发酵培养基(g/L)：KH2PO43.4，Na2HPO41.5，(NH4)2SO44.0，MgSO4·7H2O 0.7，酵母粉0.2，液体石蜡17，pH 7.0，于1.03×105Pa灭菌30 min。

1.2.2菌源微生物的富集

称取土样10 g，加入生理盐水90 mL，振荡均匀，静止12 h。取上清液按10%接种量接种到液体富集培养基中，于30℃、180 r/min的恒温摇床中振荡培养3 d。连续转接培养3次。

1.2.3生物表面活性剂产生菌的分离、筛选与鉴定

生物表面活性剂产生菌的分离、初筛：将液体富集培养液用无菌生理盐水稀释105、106、107倍，每个稀释度取0.1 mL菌液涂布于平板富集培养基上，于30℃静置培养4 d。将平板富集培养基上有乳化圈或噬油斑的菌落，进一步在平板分离培养基上划线分离纯化，挑取单菌落保藏在斜面保藏培养基上。

生物表面活性剂产生菌的复筛：将斜面保存的初筛菌株接种在种子培养基中，于30℃、180 r/min振荡培养1～3 d，再以体积分数为5%的接种量将种子培养液接于液体发酵培养基，于30℃、180 r/min振荡培养。根据液体石蜡被乳化及发酵液表面张力的变化，筛选出产生物表面活性剂的优势菌株。

生物表面活性剂产生菌的鉴定：根据《伯杰氏(Berge)菌种鉴定手册》对分离得到的部分菌株进行形态观察和生理生化鉴定。

1.2.4生物表面活性剂提取与分析

1.2.4.1生物表面活性剂的提取

将发酵液用滤纸过滤除油，滤液于3 000g离心20 min除菌，取上清液加入等体积的氯仿和甲醇(体积比为2∶1)的混合液，萃取3次。将萃取后的有机相于40℃旋转蒸发得表面活性剂粗品。

1.2.4.2生物表面活性剂的化学组成分析

将发酵液用滤纸过滤除油，滤液于3 000g离心20 min除菌，取上清液加入等体积氯仿和甲醇(体积比为2∶1)萃取所得有机相进行薄层层析。以氯仿、甲醇和水(体积比为65∶15∶2)为展开剂，以苯酚-硫酸试剂为显色剂，显棕色斑点为糖脂；以茚三酮试剂为显色剂，显红色斑点为脂肽。

取150 mg样品加入2 mol/L H2SO4，于100℃密封水解8 h，用BaCO3中和至中性，3 000g离心10 min，取上清液进行薄层层析。以氯仿、甲醇和水(体积比为65∶15∶2)为展开剂，以苯酚-硫酸试剂为显色剂，以鼠李糖为标准样品。

薄层层析用硅胶板为德国Merck公司产品silica gel 60 F254。

1.2.5生物表面活性剂产生菌的生长特性

菌体密度的测定：采用浊度法。移除发酵液上层油相，取发酵液3 mL，加入TritonX-100(0.2%)溶液0.5 mL，漩涡振荡1 min，于3 000g离心20 min，倒掉上清液，用3 mL去离子水重悬菌体，以去离子水为空白，于600 nm测定菌悬液的光密度OD600，以此表示发酵液的菌体密度。

疏水性(BATH)测定：采用BATH测定方法。移除发酵液上层油相，取发酵液3 mL，测定OD′600。加入石油醚0.1 mL，振荡1 min，静置30 s，再振荡1 min，于30℃水中静置15 min，取下层液体测定OD600。细胞疏水性BATH=OD600/OD′600。

表面张力测定：采用表面张力仪(芬兰Kibron公司)测定。将发酵液用滤纸过滤除油，滤液于3 000g离心20 min除菌，取上清液测定表面张力。

pH测定：采用pH3-3C精密pH计测定。将发酵液用滤纸过滤除油，滤液于3 000g离心20 min除菌，取上清液测定pH。

生物表面活性剂产生菌菌体密度、细胞疏水性与发酵液pH及表面张力的关系（一）

生物表面活性剂产生菌菌体密度、细胞疏水性与发酵液pH及表面张力的关系（二）